MiR-29a和PTEN在肾缺血再灌注损伤中的临床意义

李德辉,毛 毅

(重庆市开县人民医院 输血科,重庆 开县405400)

*通讯作者

MiR-29a和PTEN在肾缺血再灌注损伤中的临床意义

李德辉,毛 毅*

(重庆市开县人民医院 输血科,重庆 开县405400)

目的 探讨miR-29a和PTEN在肾缺血再灌注损伤中的表达以及临床意义。方法 饲养SD大鼠50只，构建肾缺血再灌注损伤模型，全自动生化分析仪检测大鼠血清血肌酐、尿素氮水平，qRT-PCR检测miR-29a的表达，western blot检测PTEN的表达，分析miR-29a、PTEN和肾功能的相关性。结果 肾缺血再灌注损伤模型中大鼠血清血肌酐、尿素氮水平以及PTEN表达水平显著升高，miR-29a的表达水平显著降低。相关性分析表明miR-29a和PTEN、Scr和BUN均有显著负相关性；而PTEN和Scr、BUN水平均有显著正相关性。结论 在RIRI中，miR-29a和PTEN的表达和肾缺血再灌注损伤导致的肾功能损伤有显著的联系，为针对miR-29a及PTEN基因靶向治疗RIRI提供一定的实验基础。

肾缺血再灌注损伤；miR-29a；PTEN；血清血肌酐；尿素氮

(ChinJLabDiagn,2017,21:0806)

肾缺血再灌注损伤(renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是指肾组织在缺血的基础上恢复供血以后导致组织器官的损伤程度反而加重的现象，是临床上是急性肾损伤的常见原因之一。RIRI能够对肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)造成不可逆性的损伤，明显损害肾功能，影响移植肾早期功能的恢复和长期存活，严重影响治疗效果和患者的健康[1,2]。RIRI是一个复杂的多因素调控的过程，近年来关于RIRI发生机制的研究颇多，但是确切的病理生理机制并没有明确，还未找到理想的调控靶点。因此，探索RIRI的机制对临床上RIRI的预防、诊断和治疗显得十分重要。

MicroRNA(miRNA)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码的单链小RNA，其和组织缺血再灌注损伤中有着密切的联系[3-5]。最近研究表明miR-29在RIRI中的表达存在变化[6]，但是其和RIRI的进展之间的关系还不明确。本研究通过分析miR-29以及其潜在靶基因PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)在RIRI中不同时间点的表达变化，分析其和肾损伤的相关性，明确miR-29和PTEN在临床上对RIRI的诊断意义。

1 材料与方法

1.1 材料

戊巴比妥钠，北京普博斯生物科技公司；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit购自invitrogen，SYBR Green购自Takara；引物合成于苏州金唯智；PTEN、β-actin抗体购自Santa Cruz公司；二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 动物饲养以及RIRI模型构建

清洁级雄性SD大鼠50只，体质量(200±20) g，鼠龄5周左右，饲养于21℃-25℃， 65%-70%湿度，自然光照周期环境中饲养，术前自由进食和饮水，适应性饲养7天，各组大鼠均以同样的饲养条件。大鼠采用随机数字表法分为假手术组(sham operation group，SO group)、RIRI组(RIRI group)，两组有各分为5个时间点：0天、1天、2天、5天、7天，每个时间点5只。参照文献[7]的手术方式进行RIRI模型构建：3%戊巴比妥钠按照1-1.5 ml/kg的比例进行腹腔注射麻醉。经腹正中切口，用眼科剪打开大鼠皮层，游离大鼠皮层肌层以及腹腔，切除大鼠左侧肾脏，找到并游离分出右侧肾蒂，用无损动脉夹夹闭肾蒂40 min后恢复灌注，RIRI模型构建后肾脏立即由红色变为黑紫色，SO group仅暴露肾蒂不夹闭。45 min后小心去除无损动脉夹恢复血流灌注，观察肾脏颜色由暗红色或苍白色慢慢变为鲜红色，表明成功恢复肾脏血流灌注；然后向腹腔注射1 ml灭菌生理盐水以恢复腹腔环境。手术完毕，分层缝合关闭腹腔后将大鼠置于常规环境饲养，注意给大鼠保温并恢复正常饮食，观察大鼠生命体征。分别于0天、1天、2天、5天、7天断颈法处死大鼠，取大鼠心脏血液5 ml。从大鼠背部正中取一手术切口切除肾脏，快速放入液氮中速冻备用。

1.3 肾功能检测

经大鼠心脏采血5 ml，室温放置，2 500 r /min，离心10 min，留取上层血清，Olympus AU2700 全自动生化分析仪检测大鼠血清血肌酐(Serum creatinine，Scr)、尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)水平。

1.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

MiR-29a表达采用qRT-PCR检测。收集组织样品，液氮研磨，加入1 ml Trizol提取液提取组织总RNA。miRNA逆转录采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit进行。qPCR采用SYBR Green法检测。反应体系为：cDNA 5.0 μl；上游引物0.5 μl；下游引物0.5 μl；2× SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，ddH2O 4.0 μl，总体积为20 μl。qPCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min，然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 30 s进行40个循环。以GAPDH表达为内参，相对表达水平采用2-ΔΔCt进行计算。每个样重复3次。检测引物如表1。

表1 检测引物序列

1.5 Western blot

收集组织样品，利用全蛋白提取试剂盒抽提肾组织总蛋白。BCA法测定总蛋白浓度，10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，电转；一抗(PTEN稀释比为1∶5 000，β-actin 为1∶5 000)，37℃孵育2 h，二抗室温孵育1 h，暗室放X-光片夹中，曝光显影、定影，用图像分析软件( Image Pro.Plus 6.0)对目的条带的灰度进行分析。

1.6 数据统计

2 结果

2.1 大鼠的肾功能变化

Scr、BUN水平常用于反映肾功能的变化。和SOgroup相比，RIRIgroup的Scr水平在各个时间点均显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。和SOgroup相比，RIRIgroup的BUN水平在各个时间点(0h除外)均显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。Scr、BUN水平在1天后达到最大值，然后随着时间的推移，Scr、BUN水平逐渐下降，7天后接近SOgroup。结果如表2所示。

2.2MiR-29a和PTEN在各组大鼠肾组织中的表达

MiR-29a的表达采用qRT-PCR检测，结果如表3所示。和SOgroup相比，RIRIgroup的miR-29a水平在各个时间点均显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。MiR-29a的表达在1天后达到最小值，然后随着时间的推移，miR-29a的表达水平逐渐上升，7天后接近SOgroup。PTEN的表达采用westernblot检测，结果如图1和表3所示。和SOgroup相比，RIRIgroup的PTEN水平在各个时间点(0h除外)均显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。PTEN的表达在1天后达到最大值，然后随着时间的推移，PTEN的表达水平逐渐下降，7天后接近SOgroup。

表2 各组中Scr、BUN水平

注：*表示P<0.05

表3 各组中miR-29a和PTEN表达水平

注：*表示P<0.05

图1 PTEN在各组中的表达

2.3 实验组大鼠肾组织MiR-29a和PTEN表达的相关性以及和肾功能的相关性

由表1和表2可知：从RIRI各个时间点来看，Scr、BUN和PTEN水平在1天后达到最大值，然后随着时间的推移，Scr、BUN和PTEN水平逐渐下降，7天后接近SO group，而miR-29a的表达在1天后达到最小值，然后随着时间的推移，miR-29a的表达水平逐渐上升，7天后接近SO group，该结果表明在RIRI中Scr、BUN和PTEN的表达具有相同的变化趋势，而和miR-29a的表达趋势相反，推断PTEN和Scr、BUN的表达可能具有正相关性，而miR-29a和Scr、BUN的表达可能具有负相关性。通过生物信息学分析表明PTEN可能为MiR-29a的潜在靶基因。相关性分析结果如表3所示，该结果表明MiR-29a的表达和PTEN、Scr和BUN的表达具有显著负相关性(P<0.001)，PTEN的表达和Scr、BUN水平具有显著正相关性(P<0.001)。

表3 相关性分析(相关系数r)

注：r值均为P<0.001

3 讨论

RIRI能够对RTECs造成不可逆性的损伤，明显损害肾功能。Scr、BUN水平常用于反应肾功能的变化，本研究表明RIRI中Scr和BUN水平显著升高，其中在1天后升高达到最高点，随后Scr、BUN说逐步降低，7天后Scr、BUN水平接近SO group，该结果表明RIRI能够损伤肾功能，模型构建成功。

MiR-29a是miR-29家族中的一个重要组成部分，在生物体内发挥重要的作用。在糖尿病小鼠中，miR-29表达下调，和SCr和BUN水平呈负相关，过表达miR-29能够抑制高糖环境导致的RTECs的损伤[8]。miR-29家族和缺血再灌注损伤也有着密切的联系。有研究表明下调miR-29a的表达能够保护心脏免受缺血再灌注损伤[6,9]。本研究表明miR-29a在RIRI中的表达降低，和李和文实验结果类似，李和文[10]采用基因芯片分析表明在RIRI中miR-29在RIRI中表达显著下调。本研究还表明miR-29的表达在1天后降低到最低点，随后miR-29a的表达逐步升高，7天后miR-29a的表达接近SO group， miR-29a的表达和Scr和BUN的水平呈显著负相关，该结果提示miR-29a和肾功能损伤程度呈负相关。在RIRI中，RTECs的凋亡是RIRI的早期的病理生理变化和主要的病理表现特征。mir-29a在其他疾病研究中已被认为是强有力的抗凋亡因子，它通过抑制靶基因的表达发挥其抗凋亡作用[11,12]，同时miR-29a能够阻止其他原因导致的RTECs的凋亡，保护肾组织和功能[13]。所以本研究认为mir-29a可能能够抑制由RIRI造成RTECs凋亡从而对肾组织起到保护作用，调控miR-29a的表达可能能够改善RIRI导致的肾功能损伤。

MiRNA一般通过结合靶基因的3′-UTR调控靶基因的转录。miR-29a的潜在靶基因有PUMA (P53 up-regulated modulator of apoptosis)[14]，Cdc42 (cell division control protein 42)和Srgap2 (SLIT-ROBO Rho GTPase-activating protein 2)[15]，PTEN等。本研究结果表明PTEN的表达和miR-29a的表达呈负相关，说明在RIRI中miR-29a可能调控PTEN的表达。RIRI发生机制复杂，目前认为可能与氧自由基生成、细胞内钙超载、炎症因子的激活、膜脂质过氧化等多种因素有关。PTEN为一新发现的抑癌基因，通过阻止细胞生长、过快分裂或者分裂不受控制，进而调控细胞分裂周期，在细胞生物学行为中发挥重要作用。下调PTEN能够减少ROS和炎症因子的表达，改善肠道缺血再灌注损伤[16]；在RIRI中，HIF-1/miR-687/PTEN信号通路通过下调PTEN的表达改善RIRI导致肾功能损伤[17]。本研究结果表明PTEN的表达和Scr和BUN的水平呈显著正相关，该结果表明PTEN和肾功能损伤程度呈正相关，能够作为临床上RIRI的诊断基因，抑制PTEN的表达可能能够减少ROS和炎症因子的表达，减弱RIRI导致的肾功能损伤。

总之，在RIRI中，PTEN可能是miR-29a调控的靶基因，miR-29a和PTEN的表达和肾缺血再灌注损伤导致肾功能损伤有显著的联系，为针对miR-29a及PTEN基因靶向治疗RIRI提供一定的实验基础。但是在RIRI中miR-29a对PTEN是否存在调控作用，参与调控的下游信号通路以及能否对RIRI的预防和治疗有作用还待进一步探讨，下一步拟采用细胞和动物RIRI模型分析调控miR-29a和PTEN对RIRI的预防和治疗作用，为RIRI的治疗提供更多的实验思路。

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Clinical significance of miR-29a and PTEN in renal ischemia reperfusion injury

LIDe-hui,MAOYi*.

(ThePeople’sHospitalofKaixianCounty,Kaixian405400,China)

Objective To investigate the clinical significance of miR-29a and PTEN in renal ischemia-reperfusion injury (RIRI) in SD rat.Methods 50 SD rats were fed to structure the RIRI model.The level of serum creatinine (Scr) and blood urea nitrogen (BUN) were detected by fully automatic biochemical analyser.The expression of miR-29a were detected by qRT-PCR and the expression of PTEN were detected by western blot.The correlation of miR-29a,PTEN and renal function were analyzed.Results In RIRI rats,the level of Scr,BUN,and PTEN were significantly increased,and the level of miR-29a were significantly decreased.The expression levels of miR-29a and PTEN,Scr,BUN appeared to be negative correlation in RIRI rats,in contrast,the PTEN and Scr,BUN appeared to be positive correlation in RIRI rats.Conclusion In RIRI rats,the expression of miR-29 and PTEN had significant associated with RIRI-induce renal function injury.MiR-29 and PTEN could be a potential target genes to treat the RIRI.

renal ischemia-reperfusion injury;miR-29a;PTEN;serum creatinine;blood urea nitrogen

1007-4287(2017)05-0806-04

R446.8

A

2016-11-24)