术前同步放化疗对局部晚期直肠癌临床特征和相关蛋白的影响

吴 琴 廖正凯



术前同步放化疗对局部晚期直肠癌临床特征和相关蛋白的影响

吴 琴 廖正凯*

目的：探讨术前同步放化疗(PCCRT)对局部晚期直肠癌(LARC)临床特征和相关蛋白的影响。方法：98例LARC患者按照2010年国际抗癌联盟标准进行临床分期和病理分级，平行PCCRT后统计学比较各期各级LARC患者疗效、肿瘤消退程度(TRG)、临床降期率及病理完全缓解(pCR)率。Western-blotting检测不同TRG肿瘤组织敏感性癌胚抗原(CEA)和程序性细胞死亡因子4(PDCD4)蛋白水平，并分析其与TRG的相关性。结果：经PCCRT后，LARC临床Ⅱ期和病理Ⅰ级患者的有效率较高(P<0.01)。获得有益疗效的临床各期患者出现了不同程度肿瘤消退和临床降期，临床Ⅱ期降期患者肿瘤完全消退(TRG 4级)率高于其它TRG级别；且临床Ⅱ期降期患者的肿瘤完全消退率显著高于临床Ⅲ期者(P均<0.01)。不同TRG患者CEA和PDCD4水平差异均有统计学意义(P<0.01)。与TRG 0级比较，TRG 2级患者CEA表达水平降低，PDCD4表达水平显著增加；与TRG 2级患者比较，TRG 4级患者CEA表达水平明显下降，PDCD4显著增加(P均<0.01)。TRG与CEA和PDCD4表达水平分别呈显著负相关和正相关(r分别为-0.67和0.83，P均<0.01)。结论：PCCRT可使LARC部分患者临床获益，检测肿瘤相关蛋白CEA和PDCD4水平，可评估LARC对PCCRT的敏感性和疗效，有一定实践意义。

局部晚期直肠癌；术前同步放化疗；分子生物学指标；肿瘤降期与消退；敏感性

局部晚期直肠癌(Locally Advanced Rectal Cancer, LARC)是临床常见恶性肿瘤之一，因起病隐匿，大多数患者就诊时已进展为Ⅱ期或Ⅲ期[1]，单纯手术治疗的风险及复发率均较高。临床研究表明，术前同步放化疗(Preoperative Concurrent Chemoradiotherapy, PCCRT)可局限肿瘤体积，减少肿瘤种植、降低淋巴结转移数目，以达到临床降期目的，提高患者生活质量和生命周期，降低局部复发率和远处转移率[2]。同时，PCCRT 还可降低恶性组织细胞的癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen, CEA)去分化，甚至消失[3]，增加肿瘤细胞核蛋白程序性细胞死亡因子4(Programmed Cell Death 4, PDCD4)表达[4,5]，从而使部分患者症状改善，甚至出现病理完全缓解(Pathologic Complete Response, pCR)，可避免后续手术治疗。本实验探讨PCCRT治疗对LARC患者临床降期和组织学肿瘤消退程度(Tumor Regression Grade, TRG)的影响，同时观察PCCRT后肿瘤组织中CEA和PDCD4蛋白表达情况，为临床术前应用PCCRT，也为筛选该疗法敏感蛋白，指导临床针对性治疗直肠癌提供依据。

1 资料与方法

1.1 病例临床资料

2012-02—2016-02本院胃肠外科门诊疑诊直肠癌，住院后结肠镜探查、组织活检(HE染色)确诊为LARC患者共98例，其中男61例，女37例，年龄26-79岁，平均52.5±17.3岁。进一步CT、超声、MRI及PET-CT和骨扫描检测排除远处转移；且心肺功能较好，能够耐受放化疗及手术，无怀孕及炎症性肠病，既往未接受过其它抗肿瘤治疗。参照2010年国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control, UICC)临床分期和病理分级标准[6]，确定98例患者中临床Ⅱ期43例，Ⅲ期55例；病理Ⅰ级(高度分化)37例，Ⅱ级(中度分化)46例，Ⅲ级(低度分化)15例。所有病例均先行PCCRT，后接受全直肠系膜切除根治性外科手术。本次研究均经患者签署知情同意书。留取这些患者的病理切片和活检组织用于对比分析和相关指标检测。

1.2 PCCRT联合手术切除术及标本收集

全身化疗：先静脉滴注5-氟尿嘧啶(5-Fu，国药准字，H31020593，上海旭东海普药业有限公司)，350mg/m2/天，连续3周(1周期)；后口服卡培他滨(国药准字， H20133361，齐鲁制药有限公司)，1 000 mg/m2，2次/天，连续3周(1周期)。同步放疗：于化疗周期开始时，采用常规分割法放疗，照射野为直肠癌原发灶和区域淋巴结以及瘤外缘2-5cm的安全边际，总剂量40-60GY，每次1.8-2GY，1次/天，分20-30次完成；照射中使用摆位及充盈膀胱等技术最大程度减少放射野内小肠。PCCRT结束后6-8周行腹会阴联合切除，或经腹直肠癌切除术，视情况允许和患者意愿，尽量采取低位前切术保留肛门。 迅速用生理盐水冲洗，切取癌组织中心部位，分为两块，一块置于10%中性福尔马林溶液中固定，常规石蜡包埋，HE染色，另一块立即置于—80℃冰箱冻存，待检CEA和PDCD4。

1.3 降期定义和TRG评估

临床分期由3位中、高级病理科医师组成诊断小组，依据UICC肿瘤分期标准分别对98例结肠癌患者组织活检及手术切除癌组织病理切片进行独立诊断和分期，报告结果不一致时，经讨论得出最终结论。当发现患者癌变从活检组织的Ⅱ期降为手术切除组织的Ⅰ期，从活检组织Ⅲ期降为手术标本的Ⅱ期和/或Ⅰ期，即定义该病例为降期病例，并计算降期率。TRG评估由上述病理科医师参照Dworak’s肿瘤治疗后退缩分级标准[7]，对手术标本的癌组织变化进行分级(TRG 0-4级)。其中TRG 0级为肿瘤无消退，癌组织无明显减少，纤维化不明显；TRG 1级为肿瘤轻度消退，残留癌组织多于纤维组织；TRG 2级为肿瘤中度消退，纤维组织多于残留癌组织；TRG 3级为肿瘤消退良好，极少量癌细胞残留，纤维化明显；TRG 4级为肿瘤完全消退，无癌细胞残留，显著纤维化。

1.4 疗效判定

PCCRT治疗前行盆腔超声、CT、MRI和PET-CT检查，记录原发肿瘤和转移淋巴结的大小和形态等。治疗结束2周后再行超声、CT、MRI和PET-CT检查。以肿瘤完全消退为完全缓解(CR)；肿瘤消退≥50%为部分缓解(PR)；肿瘤消退<50%或增大<25%为疾病稳定(SD)；肿瘤增大≥25%或出现新发病灶为病变进展(PD)。CR+PR为有效，SD+PD为无效，有效率=(有效例数/总例数)×100%。

1.5 CEA和PDCD4检测方法

1.5.1 主要试剂和仪器：兔抗人CEA和PDCD4单克隆抗体、二嗪比甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、溴酚蓝、牛血清白蛋白(BSA)、兔抗人单克隆抗GAPDH抗体、考马斯亮蓝G-250、丙烯酰胺、TBST缓冲液、脱脂奶粉等购自美国Sigma公司；T-Per组织蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂等购自美国Roche公司。脱水机、包埋机和切片机均为德国Leica公司产品，生物学显微镜(BX-63)由日本Olympus公司生产，图像数字分析系统(NIH Image 1.6)来自德国Kontronm公司，垂直电泳仪(PowerPacTM HC)购自美国Bio-Rad公司，Western Blot转移电泳仪(XCell SureLock)为美国Invitrogen公司产品，双通道荧光扫描仪(ODY-2182)来自美国Li-Cor公司，紫外凝胶成像系统(VL)来自美国Vilber公司。

1.5.2 检测方法：采用Western-blotting。从-80℃冰箱中取出活检和手术切取标本，加入到冰凌包绕的3支预存有1ml组织蛋白裂解液和20μl蛋白酶抑制剂的EP管中(组织标本10mg/100μl裂解液)，分别匀浆，4℃、12 000rpm离心，取少量提取物采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白质浓度，其余进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜、封闭，分别加入兔抗人CEA和PDCD4单克隆抗体(均为1∶200)和兔抗人单克隆抗GAPDH抗体，振荡温育2h，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶5 000)，再振荡温育1h，洗膜、DAB显色，紫外凝胶成像系统扫描观察和摄像。目的条带光密度值(OD)与GAPDH蛋白OD比值作为目的蛋白相对表达水平。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 不同临床分期和病理分级LARC患者PCCRT的疗效比较

不同临床分期和不同病理分级患者PCCRT有效率差异均有统计学意义(P<0.01)。LARC临床Ⅲ期患者PCCRT有效率明显低于Ⅱ期患者(P<0.01)；病理分级Ⅱ级和Ⅲ级患者PCCRT有效率均低于Ⅰ级患者(χ2=5.96、13.92，P<0.05或P<0.01)；Ⅲ级患者有效率更低(χ2=4.46，P<0.05)。见表1。

表1 98例不同临床分期和病理分级LARC患者的PCCRT疗效比较(n, %)

注：与临床分期Ⅱ期有效率比较，1)P<0.01；与病理分级Ⅰ级有效率比较，2)P<0.05；3)P<0.01；与病理分级Ⅱ级有效率比较，4)P<0.05

2.2 PCCRT临床降期LARC患者的组织学TRG分布

PCCRT后，临床Ⅱ期和Ⅲ期患者均有不同程度的临床降期，但这些临床降期与组织学TRG并非一致。表现为临床Ⅱ期降期患者组织TRG越高，降期患者越多，TRG 4级患者降期率最高；临床Ⅲ期降期患者在TRG 2级和3级中分布较多，但TRG各级分布差异无统计学意义(P>0.05)。临床Ⅱ期降期患者肿瘤完全消退(TRG 4级)率高于临床Ⅲ期患者(χ2=4.77，P<0.05)。见表2。

表2 PCCRT对临床降期LARC患者TRG的影响(n, %)

注：与临床Ⅲ期比较，1)P<0.05

2.3 PCCRT对不同TRG患者肿瘤组织CEA和PDCD4蛋白水平的影响

选择肿瘤无消退(TRG 0级)、消退不良(TRG 2级)和完全消退(TRG 4级)患者，比较PCCRT后肿瘤组织CEA和PDCD4蛋白水平的差异。结果显示，不同TRG患者CEA和PDCD4水平差异均有统计学意义(P<0.01)。与TRG 0级比较，TRG 2级患者CEA水平降低，PDCD4表达水平显著增加(t=7.45、9.54,P均<0.01)；与TRG 2级患者比较，TRG 4级患者CEA表达水平明显下降，PDCD4显著增加(t=6.02、10.71,P均<0.01)。TRG与CEA和PDCD4蛋白水平分别呈显著性负相关(r=-0.67)和正相关(r=0.83)(P均<0.01)。见表3和图1。

表3 PCCRT后不同TRG患者CEA和PDCD4蛋白水平比较

注：与TRG 0级比较，1)P<0.01；与TRG 2级比较，2)P<0.01

图1 PCCRT后不同TRG患者肿瘤组织CEA和

3 讨 论

PCCRT可显著增加围手术期LARC治愈成功率和降低局部复发率，是目前LARC围手术期的标准治疗模式[8]。该同步疗法中5-Fu和卡培他滨可使LARC患者耐受性好而获得更好临床降期率；放疗可减少肿瘤种植，缩小肿瘤体积，降低淋巴结转移数，从而达到临床降期[9]。本研究观察发现，当给予LARC患者PCCRT后，获得有益疗效的LARC患者数显著增加，尤其临床Ⅱ期或病理Ⅰ级患者获得有益疗效人数更多。表明PCCRT对LARC患者围手术期有一定治疗效果，且临床分期越低，病理组织分化程度越高者越适合开展PCCRT[10]，因其对PCCRT更敏感，疗效更好。

对LARC患者开展PCCRT是为了提高临床降期效应，降低局部复发率，使LARC患者获得较高的手术切除率和pCR率[11]。本文结果提示，PCCRT后，获得有益疗效的临床Ⅱ期和Ⅲ期患者分别下降为Ⅰ期和肿瘤消退，整体临床降期率为48.98%，与相关新辅助放化疗使约45%的LARC患者达到肿瘤降期效果的报道[12]接近。不过获得降期患者在病理组织特征上分散不一，有的还处在TRG 0级，有的发生pCR出现在TRG 3级或TRG 4级中。临床降期中，以临床Ⅱ期患者获益较大，其肿瘤完全消退(TRG 4级)例数显著高于肿瘤消退不良和不全(TRG 0级-3级)者；而临床Ⅲ期患者的获益较少。表明临床降期和肿瘤消退达到pCR并不完全同步，只有临床分期较低患者进行PCCRT才能达到较好效果，且TRG较高的患者所占比较较多。其他患者从PCCRT中获益甚微，甚至出现肿瘤恶变。

筛选评估PCCRT敏感性预测因子，可及早监测肿瘤病理变化和对放化疗的敏感程度，避免盲目地对LARC患者开展PCCRT[13,14]。CEA是肿瘤细胞黏附分子和结直肠癌去分化重要标志物，治疗前后测定CEA蛋白水平可为直肠癌患者对相关治疗提供敏感性信息。PDCD4是肿瘤抑制因子，可抑制正常细胞向无序增生的肿瘤细胞转化[15]。本实验结果表明，PCCRT获益LARC患者病理组织中CEA蛋白水平明显降低，PDCD4蛋白水平显著升高，分别与TRG呈负相关和正相关。提示临床，通过检测患者直肠病变组织CEA和PDCD4蛋白水平，可及时发现病变组织恶化程度，评估患者对PCCRT的敏感度及其疗效[16]。检测PCCRT前后LARC患者病理组织中CEA和PDCD4蛋白水平，有利于临床合理实时使用PCCRT治疗LARC患者。

综上所述，PCCRT可使LARC低临床分期和低病理分级患者获得降期和病理缓解。监测病变组织CEA和PDCD4表达水平有利于评估LARC患者对PCCRT的敏感性和疗效。

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本文第一作者简介：

吴 琴(1982-)，女，汉族，硕士研究生，主治医师，主要研究方向为肿瘤疾病放化疗防治

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The Effects of Preoperative Concurrent Chemoradiotherapy on Clinical Characteristics and CEA and PDCD4 Expression with Locally Advanced Rectal Cancer

WU Qin, LIAO Zheng-kai*

Department of Chemoradiotherapy Oncology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430070, China;*

Objective: To investigate the effects of preoperative concurrent chemoradiotherapy (PCCRT) on clinical characteristics and CEA and PDCD4 expression with locally advanced rectal cancer (LARC). Method: All pathological specimens were selected from 98 patients with LARC before and after accepted PCCRT treatments at our hoptical from February 2012 to February 2016. According to correlated standard of 2010 International Anti-Cancer Association, the clinical stage and pathological degree were further developed above mentioned all specimens. With correlated statistical softwares, effective percentage of treatment, rate of clinical downstage and tumor regression grade (TRG) as well as pathologic complete response (pCR) were analyzed and compared after PCCRT in patients with LARC. The levels of carcinoembryonic antigen (CEA) and programmed cell death 4 (PDCD4)as two sensitive biological factors were detected through Western-blotting methods and analyzed the correlations with different grades of tumor regression before and after PCCRT in patients with LARC. Results: With PCCRT, the effective percentage of treatment significantly increased among patients with LARC of clinical stage Ⅱand pathological degree Ⅰ (Pof all <0.01, respectively). Then there were different alterations on the TRG and clinical downstage in patients with LARC accepted effects of PCCRT. The cases and percentage of TRG 4 on complete response was obvious upgraded compared with that of TRG 0-3 on poor response among patients with LARC of clinical stage Ⅱ acceptedeffects of PCCRT (P<0.01, respectively). Moreover, TRG 4 patients with LARC of clinical stage Ⅱ was completed super to that of clinical stage Ⅲ (P<0.01). The quantitative results of CEA were increasingly degraded from high to nothing, and that of PDCD4 was gradually upgraded from little to more in tumor non-regression, bad-regression and good-regression groups (Pof all <0.01) as well as the grades of tumor regression had significant negative correlation with expression level of CEA (r=-0.67,P<0.01), and positive correlation with that of PDCD4 (r=0.83,P<0.01) in patients with LARC before and after PCCRT. Conclusion: The PCCRT have more clinic effects to patients with LARC. The sensitive actions were attributed to decreas or increase of expression level of CEA and PDCD4 in patients with LARC before and after PCCRT, which could be a sensitive biological factors to detect effective action in clinical practices.

Locally advanced rectal cancer; Preoperative concurrent chemoradiotherapy; Molecular biomarkers; Tumor downstage and regression; Sensitivity

武汉大学中南医院肿瘤放化疗科， 武汉 430070；*

，E-mail:18971206661@189.cn

本文2017-03-03收到，2017-04-17修回

R735.3+7 R730.58

A

1005-1740(2017)02-0050-05