丁苯酞对颅脑损伤大鼠血清S100B、NSE蛋白水平和脑组织含水量的影响

喻小平 陈谦学



丁苯酞对颅脑损伤大鼠血清S100B、NSE蛋白水平和脑组织含水量的影响

喻小平 陈谦学*

目的：观察丁苯酞对颅脑损伤大鼠脑组织含水量、血清神经生化标志物S100B和神经元特异性烯醇化酶(NSE)蛋白浓度的影响。方法：110只健康雄性SD大鼠，随机分为假手术组(n=20)、模型组(n=30)、吡拉西坦治疗组(阳性对照组，n=30)和丁苯酞治疗组(丁苯酞组，n=30)。后三组大鼠参考Feeney法复制颅脑损伤模型。成模后24h，阳性对照组给予吡拉西坦溶液(3.6g/kg/天)灌胃，丁苯酞组给予丁苯酞溶液(160mg/kg/天)灌胃，其余两组平行灌胃等量纯化水，均每天一次，连续10天。比较各组大鼠治疗期间死亡率；于药物干预第3天和第10天分批心脏取血及处死大鼠取脑组织，检测各组大鼠血清S100B和NSE蛋白含量和脑组织含水量。结果：治疗过程中丁苯酞组大鼠死亡率较模型组降低(P<0.01)，与阳性对照组无明显差异(P>0.05)。治疗后第3、第10天，各组血清S100B、NSE蛋白浓度和脑组织含水量差异均有统计学意义(P<0.01)。模型组较假手术组血清S100B、NSE蛋白浓度和脑组织含水量明显升高(P<0.05,P<0.01)；阳性对照组及丁苯酞组较模型组降低(P<0.05，P<0.01)；阳性对照组与丁苯酞组差异无统计学意义(P>0.05)。阳性对照组和丁苯酞组血清S100B、NSE蛋白浓度和脑组织含水量在治疗后第10天较第3天下降更明显(P<0.01)。结论：丁苯酞能改善颅脑损伤后大鼠脑组织水肿，降低血清S100B和NSE蛋白含量，疗效与吡拉西坦相当，具有脑保护作用。

S100B；神经元特异性烯醇化酶；颅脑损伤；大鼠

急性颅脑损伤可致脑组织挫裂伤甚至颅内血肿，引起颅内压、脑供血改变，以及大量氧自由基产生，从而导致神经细胞损伤或死亡，引起严重并发症和后遗症。有研究[1,2]表明，神经生化标志物S100B和神经元特异性烯醇化酶(Neuron Specific Enolase， NSE)等的血清浓度变化可反映颅脑损伤的严重程度及判断预后。

丁苯酞胶囊和吡拉西坦片均用于临床治疗颅脑损伤。丁苯酞胶囊属国家I类新药，其主要药效成分为芹菜籽提取物左旋芹菜甲素人工合成的消旋体。临床研究表明，丁苯酞对缺血性脑卒中患者中枢神经功能损伤有改善作用，如缩小局部脑梗死面积，减轻脑水肿，改善脑能量代谢，减轻炎症反应，改善脑微循环及抑制神经细胞凋亡等[3,4]。吡拉西坦是r-氨基丁酸的环化衍生物，可促进磷质和氨基酸吸收，增加脑内蛋白质合成，增进生物体内激酶活性，提高机体对糖的利用率和能量储存等，具有较强的抗脑缺氧作用，其治疗脑损伤疗效确切[5,6]。本研究通过复制大鼠颅脑损伤模型，观察其脑组织水肿及血清S100B、NSE水平的变化，并以吡拉西坦治疗作为对照，分析丁苯酞对颅脑损伤的脑保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

SPF级健康SD雄性大鼠110只，体重250g-300g，由武汉大学实验动物中心提供。采用随机数字表法分为假手术组(n=20)、脑损伤模型对照组(模型组，n=30)、吡拉西坦治疗组(阳性对照组，n=30)和丁苯酞治疗组(丁苯酞组，n=30)。

1.2 主要药物、仪器和试剂

丁苯酞胶囊由河北石药集团恩必普药业有限公司生产(0.1g/粒，国药准字118151025)；吡拉西坦片由湖北宜昌人福药业有限公司生产(0.4g/片，国药准字150318)。两药物(丁苯酞胶囊去除胶囊外壳)分别研磨成粉末后用纯化水溶解乳化，丁苯酞浓度为8mg/ml，吡拉西坦浓度为180mg/ml。S100B和NSE ELISA检测试剂盒均为美国R&D Systems公司产品。

1.3 复制脑损伤大鼠模型

参照Feeney法[7]复制闭合性脑损伤模型。四组大鼠采用3%戊巴比妥钠(40-50mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于鼠板上，头部剃毛、皮肤消毒，沿正中线切开头皮(长约2cm)，剥离骨膜暴露右顶骨，用牙科钻于冠状缝后1.5mm，中线右旁开2.5mm钻一直径5mm圆形骨窗(保持硬脑膜完整)。安装自制自由落体打击架，采用20g击锤从30cm高处自由落下，造成右顶叶脑组织损伤。骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，创口涂抹红霉素软膏，放回鼠笼喂养。假手术组不予打击，其余同它组。造模24h内，模型组、阳性对照组和丁苯酞组共有12只大鼠死亡，其余均符合成模标准[7]；假手术组有1只大鼠死亡(喂养过程中意外死亡)。

1.4 药物治疗

成模24h后，阳性对照组给予吡拉西坦溶液(3. 6g/kg)灌胃；丁苯酞组给予丁苯酞溶液(160mg/kg)灌胃；假手术组和模型组平行灌胃等量纯化水。每天一次，连续10天。

1.5 血清S100B、NSE含量测定

分别于成模后第3、第10天分批处死大鼠前心脏采血，离心分离血清，采用ELISA测定S100B、NSE水平，操作按试剂盒说明书。

1.6 脑组织含水量检测

各组大鼠心脏取血后断头处死，30s内取出脑组织，用滤纸吸尽脑表面血渍，锐性分离右侧顶叶皮质约100mg，置于已称重的带盖玻璃称样杯中，用电子分析天平(分度值0.1mg)称量湿重，然后再置于110℃恒温干燥箱内烘烤24h至恒重(两次称重之差≤0.2mg)称量干重，计算脑组织含水量(%)[=(湿重—干重)/湿重×100%]。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠死亡率比较

造模后24h死亡大鼠13只，余下97只大鼠进入后续实验，分别为假手术组19只，模型组25只，阳性对照组26只，丁苯酞组27只。在其后10天药物治疗过程中又有12只大鼠死亡，其中假手术组0只，模型组7只，阳性对照组2只，丁苯酞组3只。丁苯酞组死亡率(11.11%，3/27)明显低于模型组(28.00%，7/25)，差异有统计学意义(χ2=4.53，P<0.05)，与阳性对照组(7.69%，2/26)差异无统计学意义(χ2=0.00，P>0.05)。

2.2 各组大鼠血清S100B蛋白水平比较

各组大鼠药物治疗后第3天、第10天，血清S100B蛋白水平差异均有统计学意义(均P<0.01)。模型组、阳性对照组和丁苯酞组治疗后第3天和第10天血清S100B蛋白水平均较假手术组升高(P<0.05)；阳性对照组和丁苯酞组治疗后第3天和第10天血清S100B蛋白水平均较模型组降低(P<0.05)；丁苯酞组与阳性对照组治疗后第3天和第10天的S100B蛋白水平差异均无统计学意义(P>0.05)。假手术组治疗后第3天和第10天S100B水平无明显差异(P>0.05)；模型组、阳性对照组和丁苯酞组治疗后第10天S100B水平较第3天显著下降(均P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠血清S100B蛋白水平比较

注：与假手术组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.05；与同组治疗后第3天比较，3)P<0.05

2.3 各组大鼠血清NSE蛋白水平

各组大鼠治疗后第3天、第10天血清NSE蛋白水平差异均有统计学意义(均P<0.01)。模型组、阳性对照组和丁苯酞组治疗后第3天和第10天血清NSE蛋白水平均较假手术组升高(P<0.05，P<0.01)；阳性对照组和丁苯酞组治疗后第3天和第10天血清NSE蛋白水平均较模型组降低(P<0.01)；丁苯酞组治疗后第3天和第10天的NSE蛋白水平与阳性对照组差异均无统计学意义(P>0.05)。假手术组治疗后第10天与第3天的NSE水平无明显差异(P>0.05)；模型组阳性对照组和丁苯酞组治疗后第10天较第3天的NSE水平显著降低(均P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠血清NSE蛋白水平的比较

注：与假手术组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较，3)P<0.01；与同组治疗后第3天比较，4)P<0.05

2.4 各组大鼠脑组织含水量比较

各组大鼠治疗后第3天、第10天脑组织含水量差异均有统计学意义(均P<0.01)。模型组、阳性对照组和丁苯酞组治疗后第3天和第10天脑组织含水量均较假手术组升高(P<0.01)；阳性对照组和丁苯酞组治疗后第3天和第10天脑组织含水量均较模型组降低(P<0.01)；丁苯酞组治疗后第3天和第10天脑组织含水量与阳性对照组差异均无统计学意义(P>0.05)。假手术组治疗后第3天和第10天脑含水量差异无统计学意义(P>0.05)；模型组、阳性对照组和丁苯酞组治疗后第10天脑组织含水量较第3天显著降低(P<0.01)。见表3。

表3 丁苯酞对颅脑损伤大鼠脑组织含水量的影响±s)

注：与假手术组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.01；与同组治疗后第3天比较，3)P<0.01

3 讨 论

颅脑创伤是神经外科常见疾病，脑损伤后导致的严重神经功能障碍和巨大的经济负担，以及高致残率和致死率已成为全球性难题。本研究采用自由落体方法造成颅脑损伤模型，给予丁苯酞灌胃治疗10天后，其死亡率较模型组明显降低，效果与阳性对照组相当，表明丁苯酞是治疗颅脑创伤的有效药物之一。

S100B蛋白是一种酸性钙结合蛋白，属于S100蛋白家族成员之一，广泛存在于哺乳动物中枢神经细胞中，主要由神经胶质细胞合成和分泌，特别是星形胶质细胞和少突胶质细胞。有研究[8,9]表明，低浓度S100B蛋白具有神经营养作用，高浓度则有神经毒性作用，主要通过晚期糖基化终末产物(RAGE)受体刺激炎性因子的表达，导致细胞凋亡，并通过一氧化氮依赖途径诱导神经元细胞死亡，业已成为判断颅脑损伤程度及评估预后的一项可靠指标[8]。NSE是神经元细胞中的一种可溶性胞浆蛋白，仅存在于神经细胞及神经内分泌细胞的胞浆中，是神经元损伤的敏感标志物。脑损伤后，神经细胞胞膜破坏，NSE从细胞内进入细胞间隙，最终进入血液循坏，使血液中NSE含量升高，其升高幅度可反映脑损伤的程度和范围[10]。

本研究结果显示，模型组大鼠颅脑损伤后3天，血清S100B和NSE蛋白水平均升高，脑组织含水量也增加，表明成模大鼠脑组织已明显损伤。此时丁苯酞组血清S100B和NSE蛋白水平均下降，脑组织含水量也减少，至治疗后第10天，这种效应更明显，尤其脑组织含水量恢复接近至假手术组水平；且其治疗作用与阳性对照组无统计学差异。丁苯酞的这种脑保护作用与其能调节脑能量代谢、增加脑血流量、减少神经细胞凋亡有关，其具体机制可能为：(1)避免线粒体酶的自我损伤，保护线粒体功能，改善再灌注引起的线粒体肿胀和功能异常[11]；(2)保护血管内皮细胞，促进血管新生，加快侧支循环建立，增加脑血流量[12]；(3)减少线粒体电子传递链细胞色素C的释放，减少半胱天冬酶-3(Caspase-3)的表达和激活，抑制神经元细胞凋亡[13]。

综上所述，丁苯酞可缓解大鼠颅脑损伤引起的脑水肿，降低血清S100B和NSE蛋白水平，对颅脑损伤具有保护作用，其疗效与吡拉西坦相当。该结果为丁苯酞的临床应用提供了依据，具体作用机制有待进一步研究证实。

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本文第一作者简介：

喻小平(1984-)，男，汉族，硕士研究生，主治医师，主要从事神经外科及相关专业的临床研究

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Effects of dl-3n-Butylphthalide on Content of Brain Water, Serum S100B and Neuron Specific Enolase in Traumatic Brain Injuried Rats

YU Xiao-ping， CHEN Qian-xue*

Department of Neurosurgery，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China；*

Objective: To explore the effect of dl-3n-butyphthalide(NBP) on the content of brain water，serum S100B and neuron specific enolase (NSE) in traumatic brain injuried rats.Method: 110 healthy male SD rats were randomly divided into the sham group (n=20), model group(n=30), piracetam treatment group(the positive control group,n=30), and NBP treatment group(NBP group,n=30). The last three groups were made into models. The brain injury model was induced by free-falling method. Then drug was used after the traumatic brain injuriy. The positive control group was intragastric administration with pyrazole raschig solution(3.6g/kg/d). The NBP group was intragastric administration with Butylphthalide solution(160mg/kg/d). Blood samples were collected from heart on 3rd and 10th day after the drug intervention. The expression of serum S100B and NSE levels were detected by ELISA. The content of brain water of some killed rats from each group was compared. Results: Death rate in model group was higher than positive group and NBP group (P<0.01). The 3rd and 10th day after traumatic brain injury, compared with the sham group, the content of brain water，serum S100B and NSE in traumatic brain injuried rats were all increased(P<0.01). Compared with the model group, the content of brain water，serum S100B and NSE in NBP group and the positive group were all decreased(P<0.01). There was no statistically significantin positive control group and NBP group (P>0.05). Compared with the 3rd day, above detection targets on the 10th day were decreased in positive control group and NBP group (P<0.01). Conclusion: NBP can improve tissue edema rats after traumatic brain injury, down-regulate S100B and NSE level in blood. It's efficacy is equal to piracetam. NBP has the neuroprotective effect against traumatic brain injury.

S100B；Neuron specific enolase；Traumatic brain injury；Rat

武汉大学人民医院神经外科，武汉 430060；*

，E-mail:chenqx666@sohu.com

本文2017-01-18收到，2017-04-10修回

R651.1+5

A

1005-1740(2017)02-0017-04