武 童,汪振炯,吴雨龙,江海涛,周 峰,王仁雷,华 春,*,池玥兰,4
(1.南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京 211816;2.南京晓庄学院食品科学学院,江苏南京 211171;3.江苏第二师范学院生物系,江苏南京 210013;4.南京师范大学生命科学学院,江苏南京 210046)
蛹虫草基质多糖纳米硒复合物的制备研究
武 童1,2,汪振炯2,吴雨龙2,江海涛2,周 峰2,王仁雷3,华 春2,*,池玥兰2,4
(1.南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京 211816;2.南京晓庄学院食品科学学院,江苏南京 211171;3.江苏第二师范学院生物系,江苏南京 210013;4.南京师范大学生命科学学院,江苏南京 210046)
以多糖为软模板,可以制备高效低毒的纳米硒-多糖复合物。本文以废弃的蛹虫草培养基质中提取的水溶性多糖为原料,研究了蛹虫草基质多糖纳米硒复合物的制备工艺及抗肿瘤活性。实验结果表明,在多糖浓度为10 mg/mL、亚硒酸浓度为0.4 mol/L、混合时间为4 h、滴加速度为1.5 r/min 的条件下,可以制备出形貌理想、粒径适宜、稳定性良好的蛹虫草基质多糖纳米硒复合物。该复合物对Caco-2肿瘤细胞的生长具有一定抑制效果,且对细胞毒作用呈现出剂量依赖效应。
蛹虫草,多糖,硒,纳米,抗肿瘤
硒是人类和动物生命中必需的微量元素,有广泛生理功能和多种的药理作用,如抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等[1]。但硒的一个显著特征就是其营养剂量和毒性剂量之间范围比较窄,而硒的抗癌等有益生理作用往往依赖于较高的摄入量,因而限制了硒制品的直接应用[2-4]。
纳米硒(SeNPs)是尺寸在纳米级别的一种高效低毒的单质硒形态,其安全剂量远高于亚硒酸钠等传统的硒制品,已受到人们的广泛关注[5]。通常,纳米硒的制备是在调控剂(如糖、蛋白质)的作用下,利用还原剂(如抗坏血酸VC、亚硫酸钠、谷胱甘肽等)还原含硒的氧化物或者氧酸盐(如:硒酸盐、亚硒酸盐等),最终得到理想形貌和粒径并能够稳定保存的单质纳米硒[6-10]。考虑到纳米硒最终会应用于生物体系,因此,修饰纳米硒的调控物质应具有生物兼容性,最优的是可以做到生物降解的材料,如一些多肽、核酸、蛋白、多糖等生物大分子。有报道表明,选择来源广泛、生物兼容性优良并可生物降解的多糖作为还原剂和调控剂,是制备保健用甚至医用纳米硒的较优选择[11-12]。
蛹虫草基质多糖,是从废弃的蛹虫草培养基提取出来的多糖[13],具有一定的生物活性,如抗氧化、抗小鼠酒精性肝损伤等[14-16]。由于蛹虫草基质多糖具有多变的化学组成、多样化的分子量和大量的活性基团,理论上可以作为粒径、形貌和功能调控剂来制备可能具有硒和蛹虫草多糖的双重生物学功效的纳米硒多糖复合物,将在癌症的化学预防和治疗、营养保健制品方面有光明的前景。本实验以废弃的蛹虫草培养基质中提取的虫草基质多糖为原料,研究了滴加速度、亚硒酸溶液浓度、混合时间、蛹虫草基质多糖(CMSP)浓度等因素对纳米硒粒子的粒度变化影响,并进一步观察不同粒度下纳米复合粒子的稳定性,从而制备出较稳定的蛹虫草多糖/纳米硒复合物粒子(CMSP-SeNPs),并初步研究其抗肿瘤活性,为纳米硒在食品科学、生命科学、材料科学等领域的后续研究提供有益的参考。
1.1 材料与仪器
蛹虫草基质多糖本实验室自制[13];亚硒酸、抗坏血酸(VC)、溴化钾(KBr)分析纯 国药集团试剂有限公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT) sigma公司;实验中所用水新制备的超纯水;乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞A549、结肠癌细胞Caco-2、成纤维细胞HS68 南京晓庄学院细胞实验室提供。
JEM-1400型透射电子显微镜(TEM) 日本电子株式会社;JSM-7600F型热场发射扫描电子显微镜 日本电子株式会社;Zetasizer Nano-ZS 90型纳米粒度及ZETA电位分析仪 英国马尔文仪器有限公司;AFS230a型原子荧光光度计 北京海光仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 CMSP-SeNPs的制备工艺 准确称取一定量的CMSP溶于一定量的蒸馏水中,以配制不同质量浓度的CMSP溶液,再分别加入一定量不同浓度的亚硒酸溶液共混,室温下磁力搅拌一定时间后,然后利用恒流泵缓慢滴加一定量的VC溶液,边滴加边搅拌,待产物出现红色并不再加深,即可停止滴加。反应后的溶液经超纯水透析48 h除去小分子盐类之后,即可得终产物。
1.2.2 单因素实验
1.2.2.1 多糖浓度对CMSP-SeNPs的影响 分别制备浓度为0、2、4、8、10、12 mg/mL CMSP溶液,与1 mL的1.0 mol/L H2SeO3溶液混合一定时间后,利用恒流泵缓慢滴加一定量0.1 mol/L的VC溶液,直至反应体系颜色不再加深为止,随后透析得到终产物。
1.2.2.2 共混时间对CMSP-SeNPs的影响 配制10 mg/mL的CMSP基质多糖溶液,与1 mL的1.0 mol/L H2SeO3溶液分别混合0、1、2、4、12 h,利用恒流泵缓慢滴加0.1 mol/L的VC溶液,直至反应体系颜色不再加深,随后透析得到终产物。
1.2.2.3 亚硒酸浓度对CMSP-SeNPs的影响 配制10 mg/mL的CMSP溶液,分别与1 mL的不同浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol/L)的H2SeO3溶液混合4h,缓慢滴加一定量0.1 mol/L的VC溶液,直至反应体系颜色不再加深为止,随后透析得到终产物。
1.2.2.4 VC滴加速度对CMSP-SeNPs的影响 配制10 mg/mL的CMSP溶液,与1 mL 0.4 mol/L的H2SeO3溶液混合4 h,分别将恒流泵的转速设置为1.0、1.5、2.0、2.5、3 r/min,缓慢滴加一定量浓度为0.1 mol/L的VC溶液,随后透析得到终产物。
1.2.3 CMSP-SeNPs的制备工艺优化 在前期单因素预实验的基础上,以多糖浓度、混合时间、亚硒酸浓度、滴加速度等4个因素为影响因素,各选3个水平,设计L9(34)正交实验制备CMSP-SeNPs。以复合物的平均粒径作为指标,研究各因素对复合物制备效果的影响,从而确定最佳制备工艺条件。正交实验因素水平表见表1。
表1 CMSP-SeNPs制备工艺正交实验因素水平表
1.3 CMSP-SeNPs的测试与表征
采用纳米粒度分析仪测定CMSP-SeNPs的平均粒径,采用透射电子显微镜(TEM)观测CMSP-SeNPs。将少量样品溶胶均匀分散滴于铜网上,自然干燥,TEM确定SeNPs微粒的形貌、大小和均匀性,并拍摄具有代表性的电镜照片。将冻干之后的样品用SEM观察其形态,并拍摄具有代表性的电镜照片。
傅立叶变换红外光谱(FT-IR)测定样品SeNPs红外光谱。将冷冻干燥后的固体样品和KBr一起研磨,压片制样之后进行红外光谱扫描。
1.4 抗肿瘤活性测定
1.4.1 细胞培养 将几种肿瘤细胞分别置于含100 μg/mL链霉素、100 μg/mL青霉素和10%牛血清的RPMI1640培养基中,并置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。按常规方法进行传代,使细胞保持在对数期生长。
1.4.2 细胞生长抑制实验 采用MTT法测定细胞存活率。取对数生长期的细胞,用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞,以含10%小牛血清的RPMI-1640培养液稀释,制成单细胞悬液,以2.5×103个细胞/孔接种至96孔培养板中,置于培养箱中(37 ℃,5% CO2)预培养24 h后,加入含有不同浓度CMRP-SeNPs的培养基100 μL/孔,继续培养48 h。往培养板加入MTT(5 mg/mL)20 μL/孔,37 ℃孵育5 h后,吸弃上清,然后加入DMSO 150 μL/孔,微量振荡器振荡10 min,使蓝紫色沉淀充分溶解后,测定各孔OD570值。并按公式计算药物对细胞生长的抑制率[17]。
1.5 稳定性实验
将制备好的样品在室温放置2个月,观察是否出现明显的沉淀。
1.6 数据统计分析
所有实验至少重复三次,采用DPS7.05软件计算各组平行样品数据之间的标准差。
2.1 CMSP-SeNPs制备工艺研究
2.1.1 CMSP浓度对纳米复合物平均粒径的影响 CMSP浓度对纳米复合物稳定性的影响结果,如图1所示。
图1 不同浓度CMSP对CMSP-SeNPs的影响Fig.1 Effects of different concentrations of CMSP on CMSP-SeNPs注:a:0 mg/mL,b:2 mg/mL,c:4 mg/mL,d:8 mg/mL,e:10 mg/mL,f:12 mg/mL。
由图1a可见,作为对照组的无CMSP溶液调控下所制备的纳米硒粒子极不稳定,易发生聚集而产生沉淀;在低浓度CMSP溶液中,纳米硒粒子的聚沉情况有所改善,但反应体系为浑浊状态,仍有部分沉淀析出(图1b);当CMSP浓度为10 mg/mL(图1e)时,反应体系能保持30 d以上澄清透明;但是继续提高CMSP浓度至12 mg/mL(图1f)时,反应体系在18 d左右会出现浑浊直至有少许沉淀析出,造成这种结果的原因可能有两点:一是因为较高浓度的CMSP粘度较大,不能够很好地与H2SeO3溶液混合均匀,导致生成的纳米硒粒子不能被CMSP分子包裹均匀,易形成沉淀,分散性差[18];二是因为CMSP浓度过高,大分子过量时,中和了纳米粒子表面的电荷使得纳米粒子没有足够的排斥力,从而导致聚集。
利用粒度分布仪检测图1中各样品的平均粒径,结果见图2。无CMSP调控时,其平均粒径是最大的,达到了1330 nm;随着CMSP浓度的增加,纳米硒粒子的平均粒径逐渐变小,在多糖浓度为10 mg/mL时,其平均粒径达到最小,为166.7 nm。由于纳米粒子稳定性是其应用前景衡量的一个重要指标。通常说来粒度较大的纳米粒子稳定性较差,由粒度分析仪所测得结果可以很好说明图1的结果。由图1和图2可知,在一定浓度范围内,CMSP能有效作用于纳米硒粒子的稳定性,这可能是因为CMSP大量的活泼羟基会吸附在初始形成硒晶体表面,包裹在纳米硒粒子外部,阻止了粒子之间团聚结合。
图2 CMSP浓度与CMSP-SeNPs平均粒径的关系Fig.2 The relation between concentration of CMSP and particle diameter of CMSP-SeNPs
2.1.2 混合时间对纳米复合物平均粒径的影响 同样研究了混合时间对SeNPs的影响,在研究中发现除了混合时间为0 h的对照组出现沉淀外,其他四组实验组的反应体系一直呈澄清状态,甚至放置15 d后其反应体系的沉淀程度仍不明显,并不能通过肉眼观察判定其粒子稳定情况。但可观察到随着混合时间的增加,反应体系的颜色逐渐加深,这可能是因为随着时间的增加,CMSP溶液能够与H2SeO3溶液充分混合,使反应生成的红色单质硒能更多地被包裹,使其稳定存在[19]。平均粒径的检测结果(图3)表明,随着混合时间的增加,生成的粒子平均粒径变小;当混合时间为0 h时,平均粒径最大,可达到978.6 nm;随着混合时间增加,生成的纳米硒粒子的平均粒径明显降低,最低可达166.7 nm(12 h);但考虑到时间效率,因此选择混合时间为4 h最佳。
图3 混合时间与CMSP-SeNPs平均粒径的关系Fig.3 The relation between mixing time and particle diameter of CMSP-SeNPs
2.1.3 H2SeO3浓度对纳米复合物平均粒径的影响 进一步研究了H2SeO3浓度对SeNPs的影响,各反应体系沉淀情况均不明显。借助粒度分析仪进一步测定其平均粒径,结果如图4。当H2SeO3浓度为0.2 mol/L时,平均粒径最小,为99.1 nm,随着H2SeO3浓度的提高,其粒径分布及平均粒径均呈现较快增加的趋势,当H2SeO3浓度为1.4 mol/L时,平均粒径最大,为224.5nm。由于H2SeO3具有较强的毒性,如果在体系中残留量较高,对产品潜在应用存在一定影响。但如果H2SeO3浓度过低,其多糖复合物的理论载硒量同样会较低,对产品性能同样也有影响。因此,选择在亚硒酸浓度为1.0 mol/L最佳,此时纳米硒粒子为170 nm左右,并且分散性和稳定性良好,能在常温下储存超过1个月。
图4 亚硒酸浓度与CMSP-SeNPs粒径的关系Fig.4 The relation between concentration of H2SeO3and particle diameter of CMSP-SeNPs
2.1.4 VC滴加速率对纳米复合物平均粒径的影响 VC滴加速度对SeNPs平均粒径的影响见图5,反应完成后放置2 d后,各反应体系沉淀情况同样不明显。利用粒径分析仪检测样品发现,随着滴加速度的增大,生成的纳米硒粒子的平均粒径逐渐变大,当滴加速度为3 r/min时最大为170.1 nm。该现象可归因于滴加速度过快,被还原的纳米硒粒子不能及时被多糖分子吸附包裹,所以易形成团聚,粒径变大。而当滴加速度为1.0 r/min或1.5 r/min时,纳米硒粒子平均粒径都较小且相差不大,考虑到滴加速度为1.0 r/min时,用时会更长,故选择1.5 r/min最佳。
图5 滴加速度与CMSP-SeNPs粒径的关系Fig.5 The relation between dropping rate and particle diameter of CMSP-SeNPs
2.2 CMSP-SeNPs制备工艺优化
正交实验结果如表2所示。考虑到尽量要做小粒度的纳米硒复合物,因此根据各个因素极差可知道各个因素对最终产品中粒度大小的影响程度依次为C>A>D>B,即亚硒酸浓度>多糖浓度>滴加速度>混合时间。此外,根据表2还可得到最优实验条件为A2B3C2D2,即选择CMSP浓度为10 mg/mL,H2SeO3浓度为0.4 mol/L,混合时间为4 h,滴加速度为1.0 r/min条件下,所制备的CMSP-SeNPs的平均粒度相对最小,在此条件下进行验证实验发现平均粒度在178.4 nm左右,且粒径较均匀,分散性佳,室温下存放60 d无明显沉淀产生。说明在此条件下,CMSP提高了CMSP-SeNPs复合物的稳定性。
表2 制备CMSP-SeNPs的正交实验设计结果分析
2.3 CMSP-SeNPs的表征
以最优条件制备CMSP-SeNPs,图6分别所示其透射电镜(TEM)及扫描电镜(SEM)图片。由图6a可见,纳米硒粒子在溶液中以分散均匀的球形颗粒存在,分散性好,且粒径均一。同样由图6b可以观察到CMSP-SeNPs的形貌,为均匀分散的纳米硒球,这与TEM结果一致。最终产物在室温下可以放置2个月左右无沉淀。此外,将该条件下所制备的复合物经过消化后,通过原子荧光光度计测得其含硒量为54.8 mg/L,是反应体系理论值116 mg/L的一半左右,这可能是因为部分形成的纳米硒粒子过小或未被糖分子包裹,在透析过程中损失掉,与实际情况符合。
图6 CMSP-SeNPs的TEM和SEM图Fig.6 TEM and SEM images of CMSP-SeNPs注:a-TEM图,b-SEM图。
图7 CMSP-SeNPs复合物的红外光谱图Fig.7 FT-IR analysis of CMSP-SeNPs注:a-CMSP,b-CMSP-SeNPs。
2.4 抗肿瘤活性研究
采用MTT法测定了CMSP-SeNPs对肿瘤细胞的抑制作用,以成纤维细胞Hs68作为参照,通过细胞半数抑制浓度(IC50)来评估其抑制肿瘤增值的能力,结果见图8。
图8 CMSP-SeNPs对不同肿瘤细胞 和正常细胞增殖的抑制作用Fig.8 Growth inhibition of CMSP-SeNPs on various human cancer cells or normal cells
由图8可知,CMSP-SeNPs对Hela和Caco-2具有一定抑制作用,而对MCF-7抑制作用不明显,对正常细胞Hs68几乎没有影响。这一结果表明,CMSP-SeNPs对正常细胞和肿瘤细胞间具有一定选择性,且可以一定程度抑制特定肿瘤细胞活性。进一步制备了不同浓度(50、100、200、400 μg/mL)的CMSP-SeNPs溶液作用于Caco-2肿瘤细胞,并以空白多糖及Na2SeO3为对照。经过48 h的培养后,测定其对Caco-2细胞的生长抑制状况,结果见图9。
图9 样品对Caco-2细胞的生长抑制作用Fig.9 Inhibiting effect on Caco-2 of the samples
图9所示,所有样品对Caco-2肿瘤细胞毒作用呈现出一定的剂量依赖效应,即随着药物浓度的提高,样品对肿瘤细胞的抑制率也随之提高,在400 μg/mL浓度下,其对Caco-2细胞的抑制率最高。此外,在同剂量下,CMSP-SeNPs在各浓度下对Caco-2细胞毒作用均远高于原始多糖,但略低于亚硒酸钠,证明虫草多糖纳米硒复合物具有一定的抑制肿瘤活性。原糖经过纳米化修饰之后,其抗肿瘤活性得到了较大提高。考虑到亚硒酸钠为剧毒物质,其药用剂量和致死剂量相距不大,因此,虫草多糖纳米硒复合物有进一步研究的价值和潜在的开发前景。
在适宜的条件下,通过CMSP的模板调控作用,在CMSP浓度为10 mg/mL,亚硒酸浓度为0.4 mol/L,混合时间为4 h,滴加速度为1.0 r/min时的制备条件下,可以制备出形貌理想、粒径适宜、稳定性良好的CMSP-SeNPs纳米复合物。复合物的光谱特征表明,纳米硒颗粒与多糖分子中的羟基发生作用,从而形成形貌相对比较均一、稳定的纳米硒多糖复合物。MTT实验证实,经过纳米化修饰之后,极大的提高了原糖对Caco-2肿瘤细胞的抑制作用。该复合物未来具有较好的开发前景。
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Study on the preparation ofCordycepsmilitarispolysaccharide/Nano-Selenium complex
WU Tong1,2,WANG Zhen-jiong2,WU Yu-long2,JIANG Hai-tao2,ZHOU Feng2,WANG Ren-lei3,HUA Chun2,*,CHI Yue-lan2,4
(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211816,China;2.School of Food Science,Nanjing Xiaozhuang College,Nanjing 211171,China;3.Biology Department,Jiangsu Second Normal University,Nanjing 210013,China;4.College of Life Sciences,Nanjing Normal University,Nanjing 210046,China)
Polysaccharides was used as soft template to prepare polysaccharide/Nano-Selenium complexes,which had high biological activity and low toxicity. The preparation procedure of Nano-Se/Cordycepsmilitarisstroma polysaccharides complexes was investigated by single-factor experiment and orthogonal experimental design,and the water-soluble polysaccharide which was exacted from the abandonedcordycepsmilitarisculture medium was used as the raw material. The results showed that the optimal reaction conditionswere as follows:the polysaccharide concentration was 10 mg/mL,selenite concentration was 0.4 mol/L,the mixing time was 4 hours,the preparation conditions of dropping was 1.5 r/min. Under the optimal condiction,the ideal morphology,ideal particle size,stable and good nano selenium/Cordycepsmilitarisstroma polysaccharide complex particles(CMSP-SeNPs)could be successfully prepared. The antitumor experiment results showed that CMSP-SeNPs could inhibit the proliferation of Caco-2 cells,which presented a certain dose-response relationship.
Cordycepsmilitaris;polysaccharide;Selenium;Nano;antitumor
2016-08-01
武童(1988-),女,硕士,研究方向:微生物合成纳米,E-mail:1104109388@qq.com。
*通讯作者:华春(1963-),女,本科,教授,主要从事植物生理学及功能生物分子研究,E-mail:hc3501988@163.com。
国家自然科学基金项目(21376112,31471699);国家高技术研究发展计划项目(2012AA021701);江苏省自然科学基金(BK20131344,BK20141081);2015年江苏省大学生实践创新训练计划项目(201511460007Z);南京晓庄学院校科研项目(2012NXY08)。
TS201.1
A
1002-0306(2017)05-0049-06
10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.001