漳州市夏秋季主要贝类中副溶血性弧菌分布情况分析

胡元庆,周赞虎,黄玉容,张燕瑜,庄 蕾

(1.闽南师范大学生物科学与技术学院,福建漳州 363000;2.扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室,江苏扬州 225000;3.漳州出入境检验检疫局 综合技术服务中心,福建漳州 363000)

漳州市夏秋季主要贝类中副溶血性弧菌分布情况分析

胡元庆1,2,周赞虎3,黄玉容1,张燕瑜1,庄 蕾1

(1.闽南师范大学生物科学与技术学院,福建漳州 363000;2.扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室,江苏扬州 225000;3.漳州出入境检验检疫局 综合技术服务中心,福建漳州 363000)

调查漳州市售主要贝类中副溶血性弧菌的带菌状况,为消费者提供食品安全风险参考。从漳州市区的8大市场无菌采集花蛤、文蛤和蛏的新鲜样品;用硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium,TCBS)分离纯化疑似菌落,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增不耐热溶血素基因(thermolabile hemolysin,tlh)的特异片段;并对分子检测阳性的菌株进行生化鉴定。结果表明,采集到53份花蛤、50份文蛤和42份蛏的样品,经过TCBS 筛选分别得到37株、45株和36株疑似菌落,分离率分别为69.8%、90.0%和85.7%;PCR确定副溶血性弧菌阳性率分别为35.8%(19/53)、30.0%(15/50)和54.8%(23/42);革兰氏染色和主要生化实验确定疑似菌均为副溶血性弧菌,符合率达100%。漳州市所售水产品受副溶血性弧菌污染较为严重,市民食用需严格无害化处理,避免不同种类水产品间的交叉污染。

副溶血性弧菌,花蛤,文蛤,蛏,漳州市

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)是一种革兰氏阴性嗜盐细菌,是重要的污染性病原微生物。它广泛分布于近海岸的鱼类、贝类等海产品中,是引起食源性疾病的重要病原之一[1-2]。人们食用被副溶血性弧菌污染的食物后极可能会引起以腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发热等为主要症状的急性肠胃炎。副溶血性弧菌所致的食物中毒已在数量上超过沙门氏菌的中毒案例,居我国食源性致病菌的首位[3]。特别是在一些沿海城市,由该菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒总数的比例达60%以上[4]。副溶血性弧菌引起的食物中毒具有明显的季节性,以夏秋为高发季节,夏季的海产品中副溶血性弧菌的平均带菌率高达94.8%[5]。

花蛤、文蛤和蛏味道鲜美且价格实惠,是夏秋季节最常见的海产食品,也是沿海居民饭桌上常见的菜肴。但近来由副溶血性弧菌引起的海产品中毒报道屡见不鲜,如何更好的预防和控制副溶血性弧菌引起的食物中毒是食品安全的重要内容。分离检测贝类食品中的可疑副溶血性弧菌并对其鉴定,研究副溶血性弧菌的来源对食物中毒的预防和控制具有重要的意义。本实验选择PCR检测作为主要的鉴定方法,配合革兰氏染色、嗜盐性实验、3.5%氯化钠三糖铁琼脂斜面实验和氧化酶实验,保障实验结果的可靠性[6]。从漳州市场采集花蛤、文蛤和蛏样品进行副溶血性弧菌带菌情况分析,为市民食用水产食品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

水产样品 2015年7～10月,从漳州市区8个市场(新西市场,北桥市场,金峰市场,西洋坪市场,中山桥水产市场,九龙江渔业码头市场,八卦楼渔产市场,古街市场)每月各采集10份样品,共采集53份花蛤、50份文蛤和42份蛏的新鲜样品。副溶血性弧菌ATCC 17802和大肠杆菌D5株 由漳州出入境检验检疫局提供。

Tprofessional Thermocycler PCR仪 德国Biometra公司,red 个人型凝胶成像系统 美国ProteinSimple公司,MIKRO 220R冷冻离心机 德国Hettich公司。

针对副溶血性弧菌的tlh基因设计上下游引物,上游引物:5′-AAGCGGATT ATGCAGAAGCA-3′,下游引物:5′-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3′ 由上海生工合成;氯化钠、琼脂粉、牛肉浸膏、细菌学蛋白胨、TCBS琼脂培养基 广州环凯微生物科技公司;三羟甲基氨基甲烷(tris)、乙酸、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O) 国产分析纯;2×Taq Master Mix 上海捷瑞科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 无菌采样 对漳州市区8个市场的新鲜花蛤、文蛤和蛏随机抽样,先用无菌的采样袋不加运送液密封后,置于冰盒内低温快速运达实验室。采样时间在2015年7～10月,每个摊位每次采样2～3只鲜活样品,一次采样15只。

1.2.2 接种和培养 超净工作台预先紫外灭菌20 min,开启风机,在无菌操作台内点燃酒精灯,将镊子、剪刀在火焰上灭菌冷却,找到斧足肌肉外层的内脏和瓣鳃,用经过酒精灯灭菌的接种环碰触肌肉外层,划在TCBS琼脂培养基上,于培养箱中倒置培养18～24 h,观察,并记录。

1.2.3 可疑菌的纯化 待培养18～24 h后的TCBS琼脂培养基平板上长出淡绿色细菌,挑出可疑单菌落,划线于新的TCBS 琼脂培养基平板上。在培养箱中37 ℃恒温培养18～24 h后观察菌落。

1.2.4 液体培养基扩菌 在无菌操作台挑取每个TCBS琼脂平板中的一个单菌落,接种至液体培养基中,37 ℃恒温摇床180 r/min培养18～24 h,待液体浑浊后留用。

1.2.5 PCR方法初筛副溶血性弧菌 检测副溶血性弧菌tlh基因,扩增片段长度约为449 bp。水煮法制备模板,扩增体系:25 μL的PCR反应体系中含3 μL模板,上下游引物各1 μL,12.5 μL 2×Taq Master Mix(含酶),用去离子H2O补足到25 μL体系。PCR扩增条件为95 ℃,2 min,再按94 ℃,30 s变性、54.5 ℃,60 s退火、72 ℃,45 s延伸,循环扩增30次后72 ℃,10 min。在 1%的琼脂糖凝胶上电泳观察结果。

1.2.6 嗜盐性实验 PCR鉴定阳性的菌株分别接种至0、7%、10% NaCl液体培养基中。恒温振荡摇床37 ℃,180 r/min培养18～24 h,观察并记录。副溶血性弧菌在0和10%氯化钠溶液中不生长,在7%氯化钠溶液中可旺盛生长。

1.2.7 氧化酶实验 将氧化酶试纸平铺在洁净的玻片上(玻片底部用一层白纸垫上易于观察颜色变化),用移液枪吸取一滴菌液涂布在氧化酶试纸上,如果滤纸在10 s内呈现粉红色或紫红色,即为氧化酶阳性;不变色为氧化酶阴性。副溶血性弧菌为氧化酶阳性,大肠杆菌为阴性对照。

1.2.8 3.5%氯化钠三糖铁琼脂培养基斜面实验 超净工作台中进行3.5%氯化钠三糖铁琼脂斜面穿刺。将试管直立于烧杯中,在恒温培养箱中37 ℃恒温培养24 h,观察实验现象。

1.2.9 统计分析 对不同市场来源的3种样品中副溶血性弧菌分离率和阳性率进行统计分析,采用SPSS 23.0软件进行χ2检验,p<0.05表示差异显著,具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 分离纯化结果

漳州的8个市场中分别采集到53份花蛤、50份文蛤和42份蛏的样品,经过TCBS选择性培养基分别得到37株、45株和36株疑似菌落,分离率分别为69.8%、90.0%和85.7%。在TCBS琼脂培养基上,挑选蓝绿色单菌落进行分离纯化,菌落呈圆形、半透明、表面光滑。在细菌分离约3～5次后,即可观察到TCBS琼脂平板上生长的菌落全部为统一的蓝绿色,说明此时细菌已经成功分离纯化,见图1A。接种与分离的过程中,对于无蓝绿色菌落生长的平板,作无害化处理,见图1B。

图1 副溶血性弧菌的TCBS分离培养Fig.1 Isolation and culture of Vibrio parahaemolyticus on TCBS medium

2.2 PCR方法鉴定

副溶血性弧菌可在449 bp处检测出特异条带。图2中显示,样品1～7号于449 bp处出现特异性条带,判定为阳性结果。PCR确定3种水产样品中副溶血性弧菌阳性率分别为35.8%(19/53)、30.0%(15/50)和54.8%(23/42)。

图2 PCR扩增出副溶血性弧菌tlh基因的特异片段Fig.2 The specific fragment of Vibrio parahaemolyticus tlh gene by PCR

2.3 革兰氏染色

将PCR鉴定阳性菌株进行革兰氏染色,显微镜下观察到均为红色,呈革兰氏阴性,形态呈弧状或短杆状。革兰氏染色结果证明全部符合副溶血性弧菌的革兰氏阴性特征。

图3 革兰氏染色结果Fig.3 The result of strain isolated using Gram stain

2.4 嗜盐性实验结果

将PCR鉴定阳性菌进行嗜盐性实验,所有菌株均在7%氯化钠液体培养基中生长良好,在0和10%氯化钠液体培养基中不生长。嗜盐性实验结果证明PCR阳性菌株全部符合副溶血性弧菌嗜盐性特性。

图4 嗜盐性实验结果Fig.4 The result of salt tolerance test

图5 3.5%三糖铁琼脂斜面实验结果Fig.5 The result of 3.5% sodium chloride three sugar iron agar slant test

2.5 3.5%三糖铁琼脂斜面实验

PCR阳性菌株在3.5%三糖铁琼脂试管斜面实验结果为:斜面产碱变红,底层产酸变黄,不产气,如图5。根据副溶血性弧菌的培养特性,在3.5%氯化钠三糖铁琼脂斜面上层产碱为红色,底层产酸为黄色,无气泡,不变黑(不产H2S)。3.5%三糖铁琼脂斜面实验结果表明,分离的PCR阳性菌株均符合副溶血性弧菌的特性。

2.6 氧化酶实验结果

将PCR阳性菌液涂布在氧化酶试纸上,10 s内均出现紫红色,表明全部呈现氧化酶阳性,如图6。

图6 氧化酶实验结果Fig.6 The result of oxidase test注：A,B,C,D是4种副溶血性弧菌分离株的 氧化酶实验结果,紫红色为阳性。

表1 三种贝类产品中副溶血性弧菌检测结果

注：表中分离率括号中数字代表分离疑似菌与样品数之比;阳性率括号中数字代表分子鉴定阳性菌与样品数之比。

2.7 统计结果

漳州市8大市场分离率和阳性率比较差异显著(p<0.05),同一市场的3种贝类水产品中副溶血性弧菌分离率和阳性率比较差异显著(p<0.05),本实验所得数据具有统计学意义。

2.8 讨论

本实验采集的53份花蛤、50份文蛤和42份蛏的样品,经过TCBS 选择性培养基分别得到37株、45株和36株疑似菌落,分离率分别为69.8%、90.0%和85.7%;PCR确定3种水产样品中副溶血性弧菌阳性率分别为35.8%(19/53)、30.0%(15/50)和54.8%(23/42)(见表1);经革兰氏染色、嗜盐性实验、氧化酶实验和3.5%氯化钠三糖铁琼脂斜面确定PCR检测的疑似菌均符合副溶血性弧菌的生化和细菌形态染色特性,符合率达100%[7-9]。

因每个市场规模不同,故在采样选择的摊位和样品数也因市场规模大小而有所不同。从分离率和阳性率来看,8个市场来源的样品中细菌的分离率达到40%以上,中山桥市场和九龙江渔业码头市场的分离率最高,达到100%,西洋坪社区市场分离率也比较高;而阳性率以九龙江渔业码头市场为最高,达到50%以上。3种贝类样品中,文蛤和蛏中副溶血性弧菌的分离率偏高,分别为90%和85.7%;蛏的副溶血弧菌阳性率比花蛤和文蛤分别高出19和24.8个百分点。蛏中副溶血性弧菌污染较为严重,可能与其捕捞环境卫生状况有关,其高效的富集作用也可使细菌的携带量明显增加。综合分析得知,市区市场中的副溶血性弧菌携带率不高,而距离九龙江较近的中山桥和九龙江渔业码头2个市场中阳性率偏高,可能与市场中各种水产品间来源复杂,且由于缺乏规范管理而导致交叉污染的几率增加。从8个市场的调查和检测结果分析,漳州市区市场在7～10月间所售贝类均有不同程度的副溶血性弧菌污染,阳性率相对较高,市民在食用时需注意卫生和安全,充分清洗并彻底加热后食用,不要生吃或半生食用,以防食源性病原菌直接感染。本实验样品为7～10月份平均采集,每个月每种样品采集10份左右。不同月份间未表现明显分离率和阳性率差异。分析原因:漳州地区是亚热带海洋气候,5月份即进入夏季,一般每年7～10月份为最炎热天气,气温基本稳定在35 ℃左右,对副溶血性弧菌的分布影响不显著。

随着人们生活水平的不断提高和观念意识的不断更新,水产品因其较高的营养价值越来越受广大消费者的喜爱,并且许多消费者为追求水产食品的鲜美、原滋原味与新颖的烹饪方式喜欢生食水产品[10]。但是生食和食用未熟的海产品都可能引起食物中毒,威胁健康。副溶血性弧菌引起的食物中毒一般多发于5～11月,高峰季节在7～9月,有明显的季节性,但在外界环境中容易死亡。当温度为56 ℃时5 min即可将其杀灭,在食醋中只能存活1 min。所以,应进一步加强这方面卫生知识的宣传与普及,引导市民在食用花蛤及其他水产食品一定要煮熟蒸透,以确保杀死病原微生物,并提倡经常食用花蛤的市民蘸取食醋,提高对食物中毒的预防,减少食品安全隐患。同时,卫生监督部门应重视流通领域和餐饮行业的卫生监督,通过宣传教育有效加强餐饮从业人员的食品安全意识,从而减少食源性病原菌的污染。

3 结论

本文分析了漳州市7～10月8大市场的贝类水产品中副溶血性弧菌污染状况。结果表明:距离九龙江水域越近的市场,所售水产品受副溶血性弧菌污染越严重;蛏的副溶血性弧菌阳性率最高,比花蛤和文蛤分别高出19和24.8个百分点。市民食用需严格无害化处理,避免不同种类水产品间的交叉污染。

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Survey of the pollution ofVibrioparahaemolyticusfrom three shellfish products in Zhangzhou City

HU Yuan-qing1,2,ZHOU Zan-hu3,HUANG Yu-rong1,ZHANG Yan-yu1,ZHUANG lei1

(1.School of Biological Science and Biotechnology,Minnan Normal University,Zhangzhou 363000,China;2.Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis,Yangzhou University,Yangzhou 225000,China;3.Comprehensive Technical Service Center,Zhangzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Zhangzhou 363000,China)

To analyze the carrying status ofVibrioparahaemolyticusof shellfish products in Zhangzhou City and provide reference for the food safety problem of shellfish. The fresh sample were collected by sterile operation from 8 markets in Zhangzhou City. The suspected colony was obtained by culturing on TCBS plates and detected using PCR amplification of a specific tlh gene. The positive strain was verified using biochemical test and Gram staining. 53 Venerupis philippinarum,50 Meretrix and 42 Scalprum samples were collected from 8 main markets,37 Venerupis philippinarum,45 Meretrix and 36 Scalprum suspected colony were screening with TCBS selective medium. The separation rate were 69.8%,90.0% and 85.7% forVenerupisphilippinarum,Meretrix and Scalprum,respectively. PCR positive rate were 35.8%(19/53),30.0%(15/50)and 54.8%(23/42). These positive strain were confirmed by Gram staining and biochemical test. The shellfish products in Zhangzhou City are polluted byVibrioparahaemolyticus,seafood should be strictly disposed,to avoid cross contamination between different types of aquatic products.

Vibrioparahaemolyticus;Venerupisphilippinarum;Meretrix;Scalprum;Zhangzhou City

2016-09-06

胡元庆(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：食源性病原微生物控制，食品安全检测技术，E-mail:huyuanqing1979@163.com。

福建省自然科学基金面上项目(26171082)；福建省教育厅A类项目(JA14203)；漳州市自然基金项目(ZZ2014J20)；江苏省人兽共患病学重点实验室资助项目(R1402)；国家海洋局海洋生物遗传资源重点实验室开放课题(HY1503)；国家级大学生创新训练项目(201610402012)。

TS254.7

A

1002-0306(2017)05-0293-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.047