巴西橡胶树HbCYP450基因克隆与表达分析

李晓娜 肖厚贞 万三连 张冬 张宇

摘 要 细胞色素P450氧化酶催化植物初生代谢和次生代谢等多种类型的氧化还原反应。本研究在橡胶树叶片中克隆得到一个CYP450基因，编码516个氨基酸，在3～511位氨基酸序列间存在一个P450超级保守结构域，且存在特征性的血红素结合位点保守序列，与蓖麻、胡杨、毛杨果和大豆CYP450的序列一致性分别为74%、68%、68%和65%。HbCYP450基因在橡胶树的叶片、花和胶乳中均表达，但在树皮中不表达。该基因的表达量受干旱、机械伤害和白粉病的诱导，在植物激素吲哚乙酸（IAA）、茉莉酸（JA）、乙烯利（ET）、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）和过氧化氢（H2O2）作用下，HbCYP450基因表达量呈现先显著上升后显著下降的规律。说明HbCYP450是植物P450家族成员，其表达量受白粉菌和逆境诱导。

关键词 巴西橡胶树；基因克隆；表达分析；CYP450

中图分类号 S432.1 文献标识码 A

Abstract Cytochrome P450 monooxygenases catalyze a wide varieties of monooxygenation reactions in primary and secondary metabolism in plants. In this study， a CYP450 gene was cloned from rubber tree leaves. It encodes 516 amino acids which has one conserved domain at position 3-511 and a special conserved sequence of heme binding sites. HbCYP450 has identity of 74%， 68%， 68%， and 65% with Ricinus communis L.， Populus euphratica， Populus trichocarpa and Glycine max， respectively. HbCYP450 expressed in leaf， flower and latex， but no expressed in bark， which expression of gene induced by drought， wounding and powdery mildew disease.Under the treatment of IAA， ABA， SA， JA， ET and H2O2， the expression patterns of HbCYP450 were significantly upregulated， then downregulated dramatically. These results suggest that HbCYP450 is one of the members of P450 family， and the expression are induced by powdery mildew and stress induction.

Key words Hevea brasiliensis； gene cloning； expression analysis； CYP450

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.017

細胞色素P450作为植物中最大的酶蛋白家族，参与生物合成途径和生物解毒途径[1-2]。具有生物合成功能的CYP450在木质素中间物、植物激素（脱落酸、赤霉素、生长激素等）、淄醇、萜类、黄酮类等生物物质的合成中起重要作用[3-7]，具有生物解毒功能的CYP450能够使污染物、农药等有毒物质变成非毒性物质[8]。CYP450广泛存在于动植物、细菌以及真菌等细胞体内，目前从植物中获得的CYP450普遍存在于拟南芥[9]、番茄、小麦[10]、水稻、蓖麻[11]、玉米、大豆等植物中。目前，拟南芥中有40个CYP450基因功能已经确定，水稻中有39个CYP450基因功能已经确定[12]。根据CYP450蛋白序列的相似性和亲缘关系将CYP450归类为多个家族和亚家族，其中，同一家族成员的相似性大于40%，同一亚族成员的相似性大于55%[13]，同一亚家族的基因具有类似的功能[14]。

橡胶树是我国重要的产胶植物，其生长发育经常受到各种生物胁迫和非生物胁迫，其中白粉病对橡胶树的嫩叶、嫩芽和花絮均能造成危害，使植株叶片掉落，严重时会导致植株死亡。干旱和机械损伤等逆境因素会导致巴西橡胶树病虫害发生率和死皮率增加，引起巨大的经济损失[15-16]。研究发现，木质素含量会影响植株抵抗胁迫和水分运输能力[17-19]，并且高含量木质素有利于植物抗病虫害。杨家书等[20]研究发现小麦的抗白粉病能力与木质素含量成正相关。橡胶树胶乳的合成途径中涉及诸多氧化还原反应[21]，每一个氧化酶反应都需要一个专一的CYP450酶[22]，CYP450对胶乳的生产可能具有一定的影响，但目前对橡胶树中CYP450的研究甚少。笔者通过克隆橡胶树中CYP450基因，分析其在不同处理下的表达情况，为探究其在橡胶树生长发育和抗逆胁迫中的作用打下良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以中国热带农业科学院种植的橡胶树品种CATAS 7-33-97正常割胶的成龄树为材料，进行基因的克隆与不同组织的表达分析。选取稳定期生长均匀一致的橡胶树CATAS 7-33-97芽接苗进行机械损伤、白粉菌生理小种 HO-73接种、脱落酸（ABA）、乙烯利（ETH）、茉莉酸（JA）和过氧化氢（H2O2）等处理[23]。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集和cDNA的合成 机械伤害处理：在芽接苗的嫩叶上用解剖刀割出横切面，再将叶片置于水中，模拟机械损伤[24]；白粉菌处理采用Wang等[25]的方法；植物激素及过氧化氢处理方法参考Qin等[26]的方法：用乙醇溶解各种激素，喷于橡胶树芽接苗上。在处理后0、0.5、2、6、10、24、48和72 h采集样品。将不同处理下不同时间段采集到的叶片和不同组织放置在-80 ℃冰箱中冷冻保存。

提取橡胶树树皮、胶乳、叶片和花的总RNA，具体操作方法参考何鑫等[27]的方法。采用超微量核酸蛋白分析仪进行总RNA浓度和纯度的检测，并利用1%甲醛变性胶电泳进行RNA完整性的检测[28]。cDNA的合成采用RNA反转录试剂盒（Takara，中国大连）完成。

1.2.2 橡胶树HbCYP450基因克隆 根据Genbank上公布人类和一些模式植物的过氧化物酶蛋白序列，在EST数据库中进行tblastn搜索，并通过软件DNAman拼接同源片段，得到橡胶树HbCYP450基因的cDNA序列[29]。利用软件primer 6.0设计了基因特异引物HbCYP450-F（5′-TCGGTTGCTCATTG

TCTT-3′）和HbCYP450-R （5′-CAGTGGGCTACTAATACTATAC-3′），将反转录的cDNA第Ⅰ链作为模板，对橡胶树细胞色素CYP450基因的cDNA序列进行扩增。

1.2.3 橡胶树HbCYP450基因结构分析 使用NCBI ORF Finder预测基因的编码区序列以及分析巴西橡胶树HbCYP450的理化性质，通过数据库NCBI Conserved Domains、在线分析软件SMART和TMHMM Server v. 2.0分析其结构域， 用SignalP 4.1 Server预测氨基酸序列，再通过ExPASy ProtParam分析信号肽结构，亚细胞定位使用PSORT Prediction进行分析。最后在NCBI蛋白数据库中利用blastp搜索其他植物的CYP450同源蛋白并获取其序列，利用软件DNAMAN 6.0进行序列比对，利用MAGE6.0分析细胞色素P450家族系统的进化关系。

1.2.4 橡胶树HbCYP450基因表达分析 采用软件primer 6.0设计HbCYP450基因熒光定量表达分析的引物HbCYP450F（5′-ATTCTATGGCTCCGCTA

TAC-3′）和HbCYP450R（5′-TGATTGCTGCTGCTGATT-3′）。以橡胶树HbACTIN（F： GATGTGGATATCAGGAAGGA和R： CATACTGCTTGGAGCAAGA）为内参，进行荧光定量PCR反应[30]。

1.3 统计分析和作图

采用单因素方差分析和Duncan检验分析，数据统计分析采用SPSS 21.0，使用Origin 2015科技绘图软件制图。

2 结果与分析

2.1 橡胶树HbCYP450基因克隆与生物信息学分析

利用模式植物拟南芥、水稻和小麦的CYP450蛋白序列在橡胶树EST数据库中做tblastn搜索后，克隆得到全长为1 610 bp的cDNA序列，编码区长度为1 548 bp，编码516个氨基酸，分子量为59.08 ku，等电点PI为8.59，分子式为C2 687H4 233N717O735S23，总原子数为8395，其编码形成的是一种亲水且不稳定的蛋白。在3～511位氨基酸处存在一个P450超级保守结构域（图1划线部分），在5～27位氨基酸处存在一个跨膜螺旋，通过细胞定位在线分析软件可知，HbCYP450在线粒体、质膜、细胞核、内质网膜和内质网腔中定位的可能性分别是0.328 0、0.460、0.126、0.1和0.1。将同源序列进行比对分析发现，橡胶树HbCYP450与蓖麻RcCYP450（XP_002524040.1）、胡杨PeCYP450（XP_011005628.1）、毛杨果PtCYP450（XP_006380437.1）、大豆GmCYP450（XP_003556213.1）的序列一致性分别为74%、68%、68%、65%。在HbCYP450蛋白上存在一些CYP450特有的保守结构，如C-螺旋序列WXXXR，在HbCYP450中位于132～136位氨基酸，氧结合结构域AGXXT，在HbCYP450中位于314～318位氨基酸，K-螺旋序列EXXR和PXRF，在HbCYP450分别位于372～375位和426～429位氨基酸，血红素结合位点保守结构序列：FXXGXRXCXG，在HbCYP450中位于450～459位氨基酸，序列为：FGAGRRMCPG。将橡胶树HbCYP450与拟南芥CYP450进行系统进化分析发现，拟南芥CYP89A2与HbCYP450亲缘关系最近（图2）。

2.2 橡胶树HbCYP450基因的表达分析

HbCYP450基因在橡胶树的花、叶和胶乳中均有表达，且在胶乳中的表达量是叶片中的65倍，但其在树皮中不表达。白粉菌侵染橡胶树叶片时，HbCYP450基因表达量在侵染初期便显著上调，随着病害程度的加重，表达量显著增加，说明白粉菌能够诱导HbCYP450基因正向表达。在机械伤害橡胶树初期，HbCYP450基因的表达量显著上调，处理后24 h表达量达到最高值（图3）。说明HbCYP450基因参与橡胶树生物和非生物胁迫响应过程。

在植物激素诱导下，HbCYP450基因的表达情况如图4所示。在吲哚乙酸（IAA）的诱导下，HbCYP450基因的表达量在处理后6 h显著上调，到24 h表达量又显著下调。在茉莉酸（JA）、乙烯利（ET）、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）和过氧化氢（H2O2）分别处理下，橡胶树叶片中HbCYP450基因表达量的变化趋势与IAA诱导下的变化相同，其中IAA与ET、ABA、JA三者都是在处理后6 h表达量达到最高值，分别是处理前的6、25、11和20倍。H2O2和SA分别是在24 h和10 h达到表达最高值，分别是处理前的18和8倍。说明植物激素能够有规律的诱导HbCYP450基因表达，同时也说明该基因参与橡胶树植物激素处理响应。

3 讨论

P450s是多组分氧化还原酶系统[31]，在真核生物的生长发育和新陈代谢中有至关重要的作用[32]。一般来说，每一个氧化酶反应都需要一个专一的P450酶，所以在真核生物中存在大量的P450s。生物体中有很多CYPs已经鉴定出来，并且功能得到了验证。本研究在橡胶树中克隆出一个P450基因，其编码的蛋白在3～511位具有P450保守的超级家族结构域，在450～459位氨基酸存在一段血红素结合位点，序列为FGAGRRMCPG，与P450家族保守的血红素结合域FxxGxRxCxG序列相符。氨基酸序列比对结果显示，橡胶树HbCYP450的氨基酸序列与蓖麻、胡杨、毛杨果、大豆的一致性分别达到74%、68%、68%、65%，依据P450基因家族分类原则[13]，初步判断橡胶树HbCYP450属于P450家族中CYP89A2亚家族，系统进化关系分析也发现，橡胶树HbCYP450与拟南芥CYP89A2的亲缘关系最近，两个结果相一致。

橡膠树HbCYP450基因在花、叶和胶乳中均有表达，但在树皮中不表达，在胶乳中表达量最高，推测HbCYP450基因在橡胶树合成胶乳的过程中起着至关重要的作用，而在木质素形成中不起作用，或作用很小。通过NCBI发现，拟南芥中CYP45089A2具有运输电子的活性、单加氧酶活性、铁离子结合、氧结合、亚铁血红素结合的功能，参与氧化还原反应。在同一亚族的P450基因具有相似的功能，因此HbCYP450在橡胶树中可能也具有以上的作用。P450催化代谢途径可以产生重要的次生代谢产物，该次生代谢物质可增强植物抵抗病虫害和非生物胁迫的能力[33]。通过表达分析发现白粉菌侵染、机械伤害和干旱这些生物和非生物胁迫均能使HbCYP450基因表达量显著上调。肉桂酸-4-羟化酶（CHC）作为CYP450的一种（CYP73），其活性和基因的表达受创伤、金属离子、病原菌侵染等因素的调控[34-35]。HbCYP450与CYP73在进化上属于同一分支，因此可以推测HbCYP450参与病害和逆境胁迫响应。P450参与许多萜类化合物的生物合成，包括赤霉素、脱落酸和一些植物防御物质[12]，还参与生长素的合成[36]。赤霉素、脱落酸和生长素都是常见且重要的植物激素，在本研究中HbCYP450基因在5类植物激素和H2O2作用下，表达量均显著性变化。说明HbCYP450基因参与植物激素的响应。本研究为探究橡胶树CYP450家族成员和各成员在橡胶树抗病、抗逆机制奠定了一定的基础。

参考文献

[1] Ohkawa H， Imaishi H， Shiota N， et al. Molecular mechanisms of herbicide resistance with special emphasis on cytochrome P450 monooxygenases[J]. Plant Biotech， 1998， 15（4）： 173.

[2] 冷欣夫， 邱星辉. 细胞色素P450酶系的结构、 功能与应用前景[M]. 北京： 科学出版社， 2001.

[3] Ehlting J， Hamberger B， Million-Rousseau R， et al. Cyto-chromes P450 in phenolic metabolism[J]. Phytochem Rev， 2006， 5（2-3）： 239.

[4] Tanaka Y. Flower colour and cytochromes P450[J]. Phyto-chem Rev， 2006， 5（2-3）： 283.

[5] Ralston L， Yu O. Metabolons involving plant cytochromeP450s[J]. Phytochem Rev， 2006， 5（2-3）： 459.

[6] Bourgaud F， Hehn A， Larbat R， et al. Biosynthesis of cou-marins in plants： a major pathway still to be unravelled forcytochrome P450 enzymes[J]. Phytochem Rev， 2006， 5（2-3）： 293.

[7] Ayabe S I， Akashi T. Cytochrome P450s in flavonoid metab-olism[J]. Phytochem Rev， 2006， 5（2-3）： 271.

[8] Nomura T， Bishop G J. Cytochrome P450s in plant steroid hormone synthesis and metabolism[J]. Phytochem Rev， 2006， 5（2-3）： 421.

[9] Paquette S M， Bak S， Feyereisen R. Intron-exon organization and phylogeny in a large superfamily， the paralogous cytochrome P450 genes of Arabidopsis thaliana[J]. DNA Cell Biol， 2000， 19（5）： 307-317.

[10] Murphy P J， West C A. The role of mixed function oxidases in kaurene metabolism in Echinocystis macrocarpa Greene endosperm[J]. Arch Biochem Biophys， 1969， 133（2）： 395-407.

[11] Lew F L， West C A. （-）-kaur-16-en-7β-ol-19-oic acid， an intermediate in gibberellin biosynthesis[J]. Phytochemistry， 1971， 10（9）： 2 065-2 076.

[12] 贺丽虹， 赵淑娟， 胡之璧. 植物细胞色素P450基因与功能研究进展[J]. 药物生物技术， 2008， 15（2）： 142-147.

[13] Nelson D R， Koymans L， Kamataki T， et al. P450 superfamily： update on new sequences， gene mapping， accession numbers and nomenclature[J]. Pharmacogenetics， 1996， 6（1）： 1-42.

[14] Nelson D R， Werck-Reichhart D. A P450-centric view of plant evolution[J]. Plant J， 2011， 66（1）： 194-211.

[15] 李新梅. 干旱期橡胶树的管理[J]. 致富天地， 2010（5）： 31.

[16] 温福光. 物候因子干旱灾害长期预报[J]. 灾害学， 1991， 6 （1）： 89-94.

[17] Zhong R， Morrison W H， Negrel J， et al. Dual methylation pathways in lignin biosynthesis[J]. Plant Cell， 1998， 10： 2 033-2 046.

[18] Jones L， Ennos A R， Turner S R. Cloning and characterization of irregular xylem4 （irx4）： a severely lignin-deficient mutant of A. thaliana[J]. Plant J， 2001， 26： 205-216.

[19] Goujon T， Ferret V， Mila I， et al. Down-regulation of AtCCR1 gene in A. thaliana： effects on phenotype， lignins and cel wa degradability[J]. Planta， 2003， 217： 218-228.

[20] 杨家书， 吴 畏， 吴友三， 等. 植物苯丙酸类代谢与小麦对白粉病抗性的关系[J]. 植物病理学报， 1986， （03）： 169-175.

[21] 段翠芳， 曾日中， 黎 瑜. 激素对巴西橡胶树橡胶生物合成的调控[J]. 热带农业科学， 2004， （05）： 61-68.

[22] Qu X， Pu X， Chen F， et al. Molecular Cloning， Heterologous Expression， and Functional Characterization of an NADPH-Cytochrome P450 Reductase Gene from Camptotheca acuminata， a Camptothecin-Producing Plant[J]. PLoS One， 2015， 10（8）： e0135397.

[23] Wang L F. Physiological and molecular responses to drought stress in rubber tree （Hevea brasiliensis Muell. Arg.）[J]. Plant Physiol Biochem， 2014， 83： 243-249.

[24] Piffanelli P， Zhou F Z， Casais C， et al. The barley MLO modulator of defense and cell death is responsive to biotic and abiotic stress stimuli[J]. Plant Physiol， 2002， 129（3）： 1 076-1 085.

[25] Wang L F， Wang M， Zhang Y. Effects of powdery mildew infection on chloroplast and mitochondrial functions in rubber tree[J]. Trop Plant Pathol， 2014， 39（3）： 242-250.

[26] Qin B， Zheng F， Zhang Y， 2015. Molecular cloning and characterization of a Mlo gene in rubber tree （Hevea brasiliensis）[J]. Plant Physiol 175， 78-85.

[27] 何 鑫. 巴西橡胶树JAZ和MYC家族几个成员基因表达和产量相关性的研究[D]. 海口： 海南大学， 2013.

[28] 庄海燕. 巴西橡胶树水通道蛋白基因cDNA的克隆及其在乙烯利刺激下表达的初步分析[D]. 陕西： 西北农林科技大学， 2010.

[29] Chao J， Chen Y， Wu S， et al.， Comparative transcriptome analysis of latex from rubber tree clone CATAS 8-79 and PR107 reveals new cues for the regulation of latex regeneration and duration of latex flow[J]. BMC Plant Biol， 2015， 15： 104.

[30] 康桂娟， 黎 瑜， 曾日中. 巴西橡胶树HbNAC24基因克隆和表达分析[J]. 西北植物学报， 2014， 34（12）： 2 374-2 381.

[31] Wang M， Roberts D L， Paschke R， et al. Three-dimensional structure of NADPH cytochrome P450 reductase： prototype for FMN- and FAD-containing enzymes[J]. Proc Natl Acad Sci USA. 1997， 94： 8 411-8 416.

[32] Rana S， Latto S K， Dhar N， et al. NADPH-cytochrome P450 reductase： molecular cloning and functional characterization of two paralogs from Withania somnifera （L.） Dunal[J]. PLoS ONE， 2013， 8： e57 068.

[33] 赵 剑， 杨文杰， 朱蔚华. 细胞色素与植物的次生代谢[J]. 生命科学， 1999， 11（3）： 127-131.

[34] Bell-Lelong D A， Cusumano JC， Meyer K， et al. Cinnamate-4-hydroxylase expression in Arabidopsis. Regulation in response to development and the environment[J]. Plant Physiol， 1997， 113（3）： 729-738.

[35] 王亞玲， 李 群， 何祖华. 一个水稻 P450 CYP72A基因簇受病原菌诱导和发育及组织特异性表达[J]. 科学通报， 2003， 48 （21）： 2 266-2 270.

[36] Kenneth A Feldmann. Cytochrome P450s as genes for crop improvement[J]. Curr Opin Plant Biol， 2001， 4（2）： 162-167.