中国橄榄种质资源评价与抗寒性研究进展

赖瑞联 陈瑾 冯新 林丽霞 钟春水 韦晓霞 陈义挺 吴如健

摘 要 橄榄是热带亚热带特色名贵果树，其果实富含多种营养和功效成分，而寒害和冻害是橄榄产业发展的重要制约因素之一。中国拥有丰富的橄榄种质资源，深入开展资源收集评价、遗传特性分析和抗寒性研究是橄榄物种资源保护和创新利用的关键。本文综述了近年来橄榄种质资源描述评价、遗传多样性及抗寒性等方面研究概况，并对橄榄未来资源评价和研究工作进行展望，以期为橄榄生产和研究提供科学指导。

关键词 橄榄；种质资源；遗传多样性；抗寒性；研究进展

中图分类号 S667.5 文献标识码 A

Abstract Chinese olive is important characteristic fruit tree with diversified nutritional ingredients and function components， but cold injury seriously restricts the development of its industry. China has abundant Chinese olive germplasm resources， and studies on identification， genetic diversity and cold-resistance are of vital importance to conservation and full utilization. This paper reviewed the latest progresses of Chinese olive from the aspects of germplasm conservation， evaluation， genitic diversity and cold resistance. Finally， based on the current research progress， we proposed some orientations which would be helpful for the future research and industry of Chinese olive.

Key words Chinese olive； germplasm resources； genetic diversity； cold resistance； research progress

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.031

橄欖是橄榄科橄榄属常绿乔木果树，也是热带亚热带地区重要特色作物之一，在中国大面积栽培的主要是普通橄榄[Canarium album（Lour.）Raeusch.]和乌榄（Canarium pimela Koenig），其中普通橄榄又称白榄或青果，可用于鲜食和加工，而乌榄主要以加工为主[1]。橄榄营养价值丰富，其果实中含有大量黄酮类化合物、酚类化合物和氨基酸等[2-4]，在抗氧化[5-6]、保肝护肝[7]、抗菌消炎[8]和提高机体免疫[9]等方面功效显著，是一种广受欢迎的药食两用作物。

中国橄榄种质资源丰富，主要集中在福建、广东、广西、四川、台湾、云南和浙江等南部地区。多样性的种质资源为橄榄芽变优株、高药理功效品种、鲜食优良品种和抗病虫株系等筛选提供了重要遗传材料。然而，橄榄树体不耐低温，冻害和寒害是其产业发展面临的重要难题，开展橄榄抗寒性研究和抗寒品种选育成为橄榄产业向高纬度高海拔地区辐射推广、现有品种结构更新和保证橄榄稳产的关键措施之一。本文主要对橄榄种质资源调查评价、遗传多样性和抗寒性等研究现状进行综述，结合当前不足，探讨橄榄种质资源和抗寒性后续研究方向，以期为橄榄的生产和研究提供有价值的参考。

1 橄榄种质资源研究

1.1 橄榄种质资源调查

橄榄在中国分布主要集中在福建和广东。福建橄榄种质资源主要分为闽侯品种系统和莆田品种系统，其中闽东地区橄榄品种发源于闽侯品种系统，包括长营、檀香、惠圆、檀头、长穗、长梭、黄大、自来圆和羊矢，而莆仙地区橄榄品种发源于莆田品种系统，主要由下溪本、公本、六分本、尖尾钻、黄柑味、糯米橄榄、厝后本、刘族本、秋兰花、一月本、白太、黄接本和黑肉鸡等组成[10]。在福建橄榄种质资源进一步调查中，许长同等[11]首先记录了闽清橄榄品种结构并对部分良种母树展开初步筛选，而池毓斌等[12]也对福建部分鲜食优良橄榄的品种特性及良种繁育方法进行总结，从而推进福建省橄榄良种选育与区域化种植。在广东地区，钟明[13-14]和吴和原[15]等通过资源普查，记录了广东重要橄榄材料的生物学特征、果实商品性和果肉内含物等主要性状，同时比较了广东鲜食优质型、鲜食与加工兼优、中果型加工用和大果型加工用的果肉果实特性，为广东省橄榄品种结构调整和橄榄加工产业改良提供了优株来源。此外，覃振师等[16]也对广东和广西乌榄种质资源分布特点及主要栽培品种进行调查和记录评价，并从中筛选优良单株加以保护和利用。中国台湾、四川、云南和浙江等地区也分布有橄榄种质资源，但具体分布情况尚未见报道。

1.2 橄榄种质资源描述与评价

在橄榄种质资源描述和评价方面，目前有不少学者开展研究，且主要集中在叶、花和果实中。

1.2.1 橄榄叶片结构观察 韦晓霞等[17]首先采用石蜡切片解剖和观察橄榄叶片认为，橄榄叶片属于背腹异面叶，其表皮、角质层、气孔和叶脉等结构与热带亚热带气候高温高湿生态适应性密切相关，同时叶片细胞结构紧密度、细胞结构疏松度与品种间的抗寒能力一一对应，推断橄榄遗传多样性决定其叶片表型多样性，而环境多样性又深刻影响表型多样性。随后，万继锋等[18]基于《橄榄种质资源描述规范和数据标准》[19]研究发现，不同省份橄榄叶片表型差异较大，其中叶片形状、叶形指数、嫩叶颜色、成熟叶颜色和小叶数是橄榄叶片表型遗传多样性构成的主要贡献因子。杨培奎[20]进一步通过叶下表皮微形态结构观察表明，橄榄品种间存在相似的形态学特征，其表面均有条状突起物、椭圆形气孔以及较多的毛刺，然而气孔器数量、大小、毛刺长度以及表面丝状物均存在品种差异性，由此认为叶下表面气孔器、毛刺和丝状物也可作为橄榄品种分类和种质资源分析的重要性状和参考依据。此外，陈丹生等[21]也对粤东地区常见橄榄品种进行叶片切片观察，并基于叶表形状进行亲缘关系鉴定，在橄榄遗传结构分析中具有重要参考价值。

1.2.2 橄榄开花习性研究 根据Erdtman[22]分类标准，橄榄花粉属于比较小类型，为圆球形或近长球形，极面为裂圆形或钝三角形，赤面为椭圆形，且花粉被有3条萌发沟，沿极轴方向延伸，属于三孔沟类型，花粉外壁纹饰丰富，存在浅条纹型、条纹皱波型和条纹规则紧密型3种[23]。在橄榄开花模式研究中，罗美玉和许长同[24]调查认为，橄榄同树同花的雌花树比例最高，其次是同树异花的雄花与两性花混合树，且橄榄花性并非固定，随着树龄增长，同树异花树会逐渐向雌花树转变，在抽生花序方面，壮年树的抽生能力最强，而在壮年以前随着树龄增长逐渐增强，壮年后则相反，此外还开展各级枝条抽生花序比例调查，为橄榄早产矮化栽培的修剪模式提供参考。吴祖强等[25]则通过不同开花结实性的多个橄榄无性系观察认为，个体的遗传基础是造成不同无性系幼龄橄欖开花结实表现差异的主要因素。

1.2.3 橄榄果实性状描述 橄榄果实性状方面，林河通[26]首先制定了福建省主栽橄榄品种果实形态解剖检索表，同时对不同品种果实特征进行比较认为，橄榄品种的耐贮藏性与外果皮角质层、中果皮机械组织及果肉中大小2型细胞量比密切相关。随后，陈思聪[27]提出福州多个鲜食橄榄果形指数、单果重、可食率和可溶性固形物等指标明显符合偏正态分布，这种结果可能源于长期的人工定向选择，其果实性状定性描述也进一步补充和完善了《橄榄种质资源鉴定技术规程》[28]。基于农业部福州橄榄种质资源圃，吴如健等[29]对全国不同分布区橄榄果实表型性状开展全面分析，系统完善了橄榄种质资源果实表型数据，且认为在多种描述类型中单果质量变异系数最大，而可食率变异最弱，另一方面，这些橄榄种质资源集中偏向果皮黄绿色、放射纹不明显、果肉黄白色、质地硬韧和风味苦涩等12种类型，而果皮青色、果实近圆形和不规则、放射纹明显以及汁液少等7种描述类型出现频率非常稀少。此外，陈思聪和周俊辉等[30-31]分别采用层次分析法和果实外观营养比较提出了福州和潮汕地区鲜食橄榄重点选育目标。而在乌榄果实性状评价方面，覃振师等[32]通过果实主要农艺性状与营养成分相关性比较，明确了桂西南地区乌榄优良栽培品种的开发利用价值。

1.3 橄榄种质资源遗传多样性研究

1.3.1 基于表型数量性状的橄榄种质资源分类

表型性状是基因和环境共同作用的结果，表型数量性状多样性分类是作物遗传变异最直接有效和简便易行的检测方法[33]。目前，橄榄表型多样性分类研究较少，仅在橄榄果实和花粉中有相关报道。基于橄榄果形、果重、果色和果实风味等农艺性状，吴如健等[29]采用Q型和R型分类法将中国主产区橄榄遗传资源进行准确归类，而这一分类中的主要贡献成分包括果实性状、果顶形状、果基形状、果形指数、核型指数、单果质量、单果核质量和果肉质地等，此外，适宜鲜食和适宜加工品种之间界限明确，多数性状表现两两互相关联。在橄榄花粉形态学分类中，韦晓霞等[23]研究发现橄榄不同类别之间的地域性明显，同一类群中橄榄花粉的基本特征较为一致，揭示了不同地区橄榄雄株花粉可能存在较大差异。橄榄表型数量性状分类研究为橄榄种质分类体系构建提供了一定的参考价值，然而，作物外观表现起源于基因型却往往受环境饰变[34]影响，橄榄遗传多样性分类也需进一步结合分子生物学开展深入研究。

1.3.2 分子标记技术在橄榄种质资源研究中的应用

ISSR是物种遗传多样性研究中最为常见和通用的技术手段。在橄榄种质资源ISSR遗传多样性研究中，杨培奎和刘天亮等[35-36]首先建立和优化了ISSR-PCR反应体系：20 μL体系中添加Mg2+ 3.0 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L或0.225 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U，模板DNA 40 ng或80 ng以及引物0.25 μmol/L，2种方法之间差异较小，验证其可能为橄榄ISSR试验的有效反应体系。基于该结果，刘天亮[37]对全国60个橄榄品种进行遗传多样性分析发现，橄榄品种间的亲缘关系较近且相似地理环境的种群遗传多样性较一致，橄榄大部分遗传变异发生在种群内部但种群间仍存在一定的基因交流，此外福建省内橄榄品种遗传多样性较为丰富。在广东省橄榄种质资源研究中，杨培奎等[38-41]也采用ISSR技术构建了粤东和潮汕地区代表性核心种质，并发现该地区橄榄总体遗传多样性水平较低，同时，根据类群划分与材料来源地比较对该地区橄榄同名异物现象进行校正。此外，ISSR在橄榄变异株系亲本鉴定中也有应用和相关报道[42]。

RAPD是一种能够直观反应染色体DNA多态性的分子标记技术，广泛应用于动植物遗传多样性分析、遗传结构划分、指纹图谱构建和基因定位等。在橄榄种质资源RAPD遗传分类中，聂珍素等[43-44]首先构建了RAPD-PCR最优反应体系，而采用该体系对福建省27份橄榄种质资源进行比较发现，橄榄遗传分化较大，存在遗传背景复杂性和丰富性，这与其他人的研究结果存在一定差异，可能与取样范围和对象或试验方法有关。与此同时，陈瑞庆[45]通过橄榄RAPD-PCR反应程序、反应体系和随机引物等影响因素比较试验认为，橄榄RAPD存在重复性问题，其分类结果也有待验证。可见，传统RAPD技术在橄榄资源分类中的应用需要进一步探索和改良。基于这些研究结论，Mei等[46]采用改良RAPD法分析了四川境内长江流域橄榄遗传结构并进行种质鉴定，随后，Cheng等[47]根据这种改良技术开发适用于橄榄分类和鉴定的物种特异SCAR标记QG12-5，进一步丰富了橄榄种质资源研究方法。

SRAP、AFLP、SCoT、SSR和ITS序列等也是作物遗传分析中常用手段，在橄榄中也有相关报道。首先，张平湖和王燕平等[48-50]分别对SRAP和AFLP PCR反应体系和反应程序中关键影响因子和水平进行筛选，建立了相应技术体系并在部分橄榄品种中进行初步检验。随后，王燕平和周俊辉等[49，51]采用橄榄AFLP-PCR分析发现广东省鲜食橄榄品种遗传多样性丰富，同时也对该地同名异物和同物异名现象进行区分和鉴别，结果充分验证AFLP在橄榄研究中的适用性和可行性。覃振师等[52]基于目标起始密码子多态性进行广西乌榄种质资源SCoT标记分析，认为其遗传多样性水平较低，而亲缘关系与地理起源相关。此外，Zhang等[53]开发了适用于橄榄和乌榄的SSR标记引物，并建立相应的扩增体系。生物体中ITS存在ITS1和ITS2 2种，其在核糖体DNA中分别位于18S和5.8S以及5.8S和26S之间非编码转录间隔区，宋亚娜和陈瑞庆等[45，54]克隆了橄榄18S～26S rRNA和ITS片段，并对福建省多个品种橄榄ITS序列进行同源性比对和亲缘关系分析，认为福建省栽培橄榄品种间的差异主要存在少数个体间，大部分同源性较高；而杨培奎等[55]也通过试验发现ITS仅可作为部分橄榄品种特异DNA指纹鉴定的依据，广东汕头、潮州、揭阳和梅州等地一半以上橄榄品种的ITS序列完全一致，与所对应的农艺性状存在明显偏差。可见，橄榄ITS序列比对仍需结合其他技术手段以保证结果的准确度和可靠性。

2 橄榄抗寒性研究

2.1 橄榄寒害调查与预防

低温冻害是橄榄产业面临的重要自然灾害，其外因主要与温度降低程度、低温持续时间、地势和空气相对湿度等有关，内因则取决于树体本身抗寒能力。福建地区极端气温低于-2.0 ℃时，橄榄叶片开始受冻，低于-2.7 ℃时，末一枝条受冻，而当最低温低于-3.0 ℃时，末二枝条受冻，严重影响橄榄产量和种植效益[56]。长期以来，科研工作者也对橄榄主产地区尤其是福建省橄榄冻害情况展开调查。在已有的报道中，福建省上杭橄榄产区1992年低温冻害导致5～6年生幼年树全部枝条和30～40年生成年树直径4.6 cm以下枝条全部冻死，叶片脱落，而2003/2004年该地橄榄再度连续2次遭受严重低温霜冻[57-58]；福建省橄榄最主要产区之一的闽清，1999年低温冻害使其橄榄3级以上冻害达97.6%，翌年90%以上投产园欠收，减产7成，在2004/2005年全县94.3%的橄榄遭受冻害再次大面积减产[59-62]；福建省另一橄榄主产区闽侯在2011年大冻害中，距闽江流域1 km内橄榄园发生1级冻害，20%叶片和嫩枝受冻，而随着距离延伸冻害程度上升，3 km以上出现大面积3级冻害[63]。此外，福建省其他地区也同样出现过大规模橄榄低温冻害致使次年产量锐减[64-65]。可见，低温冻害已严重威胁现有产区橄榄产业的持续发展，同时制约着橄榄产业进一步向高纬度高海拔地区辐射推广，而现有橄榄产区采取有效措施进行冬季防寒防冻也尤为关键[66]。调查发现，福建闽江中下游橄榄中心产区距闽江1 km区域且海拔低于150 m区域适宜橄榄栽培，且10年生以上橄榄树具有较强耐低温能力，基于此张家栋[67]提出了福建橄榄适地适树的栽培原则。而王加义等[68]根据GIS技术系统分析认为福建省中部、南部沿海以及部分河谷地块为橄榄适宜栽植区，而现有橄榄产区闽清、上杭和尤溪为潜在高风险冻害区域，但影响因子地域分布并不均匀，以尤溪低温冻害程度和频率最高。橄榄低温冻害调查与防冻精细区域规划为后续福建省橄榄产业发展和改良提供了重要参考依据。

2.2 橄榄抗寒生理生化研究

2.2.1 细胞或组织器官形态结构研究 低温冻害往往引起橄榄细胞间隙水分凝结成冰晶并继续从细胞中吸收水分而逐渐增大，进而压迫细胞使细胞损伤引起原生质体凝固，短时间内气温缓慢回升时橄榄细胞可能重新恢复，而一旦气温急剧上升则水分蒸腾过快造成细胞失水死亡，树体枯萎[66]。因此，栅栏组织和上皮组织细胞排列紧密、角质层增厚和孔隙率小的橄榄品种往往表现更强的抗寒能力[12]。

2.2.2 生理生化代谢研究 在橄榄抗寒性生理生化研究中，王剑、郑家基和韦晓霞等[69-71]通过叶片孔隙率、酶活、可溶性蛋白和可溶性总糖等指标综合评定筛选出了丁香、羊矢、长营、葡萄和自来圆等一系列可能的耐寒优株。此外，同一橄榄品种中实生树抗寒能力高于嫁接树，春叶也比秋叶耐寒[72]。

2.2.3 果实抗冷生理生化研究 低温冷藏是果实保鲜的重要环节，不同果实耐低温能力的差异也容易造成果实冷害，影响商品性状。橄榄果实贮藏过程中对温度非常敏感，低温可以抑制橄榄果实呼吸作用，维持保护酶相对稳定，减少氧化作用，同时促进果实多胺类物质合成，抑制病原菌活性，并延缓果实衰老，其中6～10 ℃可能为橄榄冷藏适宜的温度区间，尤其（8±1）℃贮藏可避免橄榄果实冷害发生并较好地保持橄榄果实品质，一旦贮藏温度低于6 ℃橄榄果实表面凹陷，果表呈水渍状或烫伤状，果肉褐变[73-77]。进一步研究发现，橄榄果实遭遇冷害后叶绿素含量与MDA含量、褐变指数和腐果率呈负相关，说明低温破坏橄榄叶绿体膜，导致叶绿素降解是其果实部位变色的重要原因，因此，叶绿素含量也常常作为橄榄果实冷害的指示性指标[76]。在橄榄果实冷害预防的相关研究中，孔祥佳等[78]通过不同采收期冷藏橄榄冷汗指数、褐变指数、好果率和损失率等比较确定立冬时节为预防橄榄果实冷害的最佳采收时期，其具体农艺性状为果实黄绿各半，饱满，果肉黄色，果核土黄色，肉质细，回甘好，提前采收往往由于冷藏期间冷害导致果实无法正常后熟，推迟采收则营养消耗过快加剧果实冷害；此外，38 ℃热空气诱导处理30 min可显著降低橄榄果皮脂氧合酶LOX活性而减少膜脂不饱和脂肪酸的降解，同时降低橄榄果皮饱和脂肪酸的相对含量，维持较高膜流动性，减轻橄榄低温贮藏过程中冷害发生[79-80]。

3 展望

基于目前橄榄种质资源研究现状和不足，后续资源开发和利用主要可从以下几个方面进行，包括橄榄种质资源核心种质构建、新品种选育、抗寒机理解析、抗寒栽培技术更新并最终实现资源創新利用（图1）。

3.1 完善橄榄种质资源描述基础数据

资源收集与鉴定是物种种质创新利用的基础。目前，橄榄种质资源收集工作已经取得较大成效，然而其后续研究和开发仍处于相对初级阶段，橄榄品种之间农艺性状、生物学特征和抗逆性等基础数据不完善，地区之间橄榄同名异物和同物异名现象普遍，遗传结构混乱，遗传背景尚不明确。因此，进一步开展橄榄种质资源描述、鉴定与评价具有重要意义。橄榄种质资源圃的建立为丰富多样的橄榄遗传材料提供了相对一致的气候、环境和土壤等外界条件，依据《橄榄种质资源描述规范和数据标准》进一步完善橄榄种质资源基础数据库，可为指导橄榄高效栽培管理、产业结构调整和改良、优良变异株系筛选与推广、优质抗性新品种定向选育以及杂交育种等提供科学依据。

3.2 针对性开发适用于橄榄的新型分子标记技术

ISSR或RAPD等传统分子标记技术在不同作物中具有普遍通用性，细化到特定物种则灵敏度相对较弱，也是造成现有橄榄分类结果各异的重要因素之一。因此，基于橄榄基因组或转录组测序，参考模式生物研究方法，开发橄榄特异性SNP、SSR或PAV分子标记技术将在很大程度上提高橄榄遗传多样性和遗传结构分析结果的准确性。而在橄榄遗传特征研究基础上，系统构建不同地区和品种之间橄榄种质资源指纹图谱，挖掘橄榄核心种质，针对性建立橄榄核心种质保存库也是提高橄榄种质资源保存和利用效率的关键。

3.3 开展橄榄抗寒栽培技术和抗寒机理研究

橄榄属于中国热带亚热带特色果树，其抗寒能力较弱，而由于中国南方地区特殊的地理位置和气候条件，橄榄常常面临低温冻害而导致产量骤减甚至树体死亡，橄榄供不应求，市场价格暴涨，而果农损失严重，栽培效益低迷。因此，开展橄榄抗寒性研究对橄榄产业的持续稳定和健康发展具有重要意义。在应用研究方面主要包括，基于橄榄种质资源圃丰富的橄榄遗传材料筛选抗寒性砧木，研究能够明显提高橄榄抗寒并具有生产推广可行性的嫁接或修剪方法，结合成本效益分析不同类型抗冻剂在橄榄中的适用性等，从而提高生产上橄榄抵御低温冻害的能力。另一方面，采用现代测序技术开展橄榄低温胁迫下的转录组学、miRNA组学、lncRNA组学、蛋白质组学和代谢组学等方面的研究，挖掘橄榄抗寒关键基因和非编码核酸序列，关联分析已有橄榄抗寒相关的生理生化研究结论，从本质上揭示橄榄抗寒的分子和生理机制，也可为橄榄抗寒栽培技术更新和耐低温新品种选育提供科学依据。

3.4 现代生物技术在橄榄中的应用

目前，生物技术在橄榄中的应用相对较少，限制和阻碍了橄榄生产和研究工作的开展。例如，植物组织培养在作物资源保存、种苗繁育和脱毒等领域均有广泛应用，而橄榄试管苗离体培养存在诱导难度大、增殖系数低、继代成活率低等难题，在后续研究中可参考杨树、龙眼和荔枝等植物通过诱导胚性愈伤组织进行体细胞胚胎发生构建橄榄离体培养体系，同时采用胚性愈伤组织限制生长保存法进行橄榄核心种质离体备份保存，通过短周期生长、高效率增殖和高频率再生提高橄榄种质资源创新利用效率，甚至可以基于橄榄体细胞胚胎发生系统实现橄榄优异基因本物种遗传转化进行基因功能鉴定和分子育种。此外，随着现代生物技术在农业中的推广和应用，转录组学、基因组学、代谢组学和基因编辑等一系列新型技术手段也必将在橄榄中得到应用，并推动橄榄生产和科研水平实现质的飞跃。

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