羊耳菊有效组分化学成分分析

2017-05-30 15:53巩仔鹏熊荻菲菲李梅吴林霖陈亭亭李月婷陈思颖王爱民李勇军

安徽农业科学 2017年29期

巩仔鹏熊荻菲菲　李梅吴林霖　陈亭亭　李月婷　陈思颖　王爱民　李勇军

摘要 [目的] 分析羊耳菊有效组分中的化学成分。[方法]采用UHPLC-Q-TOF-MS技术，对其中主要的化学成分进行表征，指认其中特征性、代表性的化学成分，并通过对照品进行比对。[结果]在羊耳菊有效组分中鉴定出12个化合物，分别为绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、洋蓟素、木犀草苷、东莨菪苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖（6→1）-α-L-鼠李糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。 [结论]明确了羊耳菊有效组分中的12个化合物，为羊耳菊药材的质量控制指标成分的选择提供依据。

关键词羊耳菊；超高效液相色谱—飞行时间串联质谱；化学成分

中图分类号 R284.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）29-0131-03

1.2.4 质谱条件。

采用电喷雾离子源，扫描方式为正、负离子扫描（ESI+、ESI-，m/z 50～1 000），毛细管电压（正离子模式4 kV，负离子模式3.5 kV），锥孔电压80 V，离子源温度110 ℃，雾化气（N2）压力1.3 bar，流速6 L/min，温度180 ℃，脱溶剂气温度300 ℃，气体体积流量50 L/h，脱溶剂气体积流量550 L/h，用甲酸钠校正质量数，校正模式选用Enhanced Quadratic，数据分析采用Data Analysis软件、Metabolite ToolsTM（包括Metabolite Predict及Metabolite Detect）软件、质量亏损过滤（MDF）。

1.2.5 样品测定。

分别吸取羊耳菊活性组分样品溶液和混合对照品溶液各2 μL 于Bruker MicroTOF-Q Ⅱ高分辨质谱仪，采用标准对照品、分析正负离子模式扫描及碎片离子分析等方法，对羊耳菊有效组分进行化学成分分析。

2 结果与分析

2.1 正负离子模式的选择

从羊耳菊有效组分的正离子和负离子模式色谱图（图1）可以看出，试验在相同条件下，正离子模式下综合的各成分响应较负离子模式的大，因此试验选择正离子模式为测试模式。

2.2 羊耳菊有效组分质谱信息分析

通过对有效组分正离子模式的一级质谱进行分析，同时结合文献分析大致推断出各成分信息，结果见表2。

分析图2中标记的12个峰发现，峰5、8、9和11均为二咖啡酰基奎宁酸类同分异构体，去质子化的分子离子m/z为515，结合文献[5，7-9]了解到羊耳菊中分离得到的二咖啡奎宁酸有异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、洋蓟素等，因此，进一步结合对照品比对，确认了峰5为洋蓟素，峰8为异绿原酸B，峰9为异绿原酸A，峰11为异绿原酸C。峰1、2、3、4的去质子化的分子离子m/z 都为353，而羊耳菊现有文獻报道中仅有东莨菪苷这一个化合物的分子量与其一致[7]，而m/z 353为二咖啡酰基奎宁酸类失去 1个分子咖啡酸得到m/z 353的单咖啡酰基奎宁酸去质子化碎片，因此推测这4个峰中有一个为东莨菪苷，其余3个可能为单咖啡酰基奎宁酸类化合物，中药中常见的单咖啡酰基奎宁酸有绿原酸、隐绿原酸等。因此，进一步结合对照品比对，确认了峰1为新绿原酸、峰2为东莨菪苷、峰3为绿原酸、峰4为隐绿原酸。

峰6、7、10、12均为黄酮类化合物，峰7在正离子模式下得到准分子离子峰为[M+H]+ m/z 449，提取出可能的分子式为C21H20O11，与文献报道[8]相比较，推测其为木犀草素C15H10O16得到一个葡萄糖，因此初步推断该成分为木犀草苷，之后通过对照品进行比对，进一步验证了推断结果。峰6在保留时间为8.1 min时，正离子模式下得到准分子离子峰为[M+H]+ m/z 595，其碎片离子峰为[M+H]+m/z 449、m/z 287，m/z 449为m/z 595失去1个分子鼠李糖，而m/z 449为木犀草苷，与参考文献[10]一致，故可以推测峰6为木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖（6→1）-α-L-鼠李糖苷。峰10在保留时间9.3 min时，正离子模式下得到准分子离子峰为[M+H]+m/z 463，正离子模式下的二级质谱碎片峰主要为[M+H]+m/z 287，峰10失去1个分子葡萄糖醛酸得到m/z 287的碎片离子，结合参考文献[11]，推测峰10为木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。峰12在保留时间为128 min时，正离子模式下得到准分子离子峰为[M+H]+ m/z 433，正离子模式二级碎片离子主要为[M+H]+m/z 271，结合参考文献[11]，推测其为m/z 433失去1个分子葡萄糖得到m/z 271的芹菜素加氢的碎片离子，推测峰12为芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

3 讨论

复杂中药体系的分析一直是分析领域的热点和难点，也是中药现代化的瓶颈之一，而中药药物化学成分的分析和验证是整个药效物质基础研究的重要环节和基础[12-13]。UHPLC-Q-TOF-MS与其他方法相比，由于其离子传输效率高、重现性高、灵敏度高、错误率低等优点，其在复杂中药体系的分析中具有明显优势。因此，该研究采用超高效液相色谱-飞行时间串联质谱（UHPLC-Q-TOF-MS）仪对羊耳菊抑菌、抗炎有效组分的化学成分进行分析，建立了一种快速、高效、准确的化学成分分析方法。

研究采用高分辨质谱精确质量和同位素峰型匹配，对有效组分中特征性、代表性的化学成分进行了高分辨质谱表征，初步确定化合物的分子式，同时结合相关文献报道，确认了其中12种化合物。由于提取物中存在着大量结构类似的同分异构体，不但分子式一样，并且有相似的裂解方式，如新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸，因此，该试验采用对照品比对，将其区分和进行进一步确认，12种化合物分别为绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、洋薊素、木犀草苷、东莨菪苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖（6→1）-α-L-鼠李糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

在羊耳菊抗炎有效组分中酚酸类化合物绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A等为其主要化学成分。在同科植物金银花中已有文献报道，金银花中含有的大量苯丙素类化合物，其中绿原酸、异绿原酸和咖啡酸等是其主要抗炎活性成分之一，同时文献研究证明，金银花具有较强的广谱抗菌作用，且抗菌活性的强弱也与苯丙素类化合物（绿原酸、异绿原酸等）的含量显著相关[14-16]。因此，初步推断羊耳菊的抑菌、抗炎药效与苯丙素类化合物有一定联系，该研究为羊耳菊抑菌、抗炎活性成分的发现奠定试验基础，初步阐明其药效物质基础，并为下一步质量控制研究提供了特征性的代表指标成分。

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Analysis of Chemical Constituents of Effective Components of Inula cappa

GONG Zipeng1，2，3，4， XIONG Difeifei1，2，3，4， LI Mei1，2，3，4，LAN Yanyu1，2，3，4* et al

（1. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics， Guizhou Medical University， Guiyang，Guizhou 550004；2. Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM （Ministry of Education）， Guizhou Medical University， Guiyang，Guizhou 550004；3. School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang，Guizhou 550004；4. National Engineering Research Center of Miaos Medicines， Guiyang，Guizhou 550004）

Abstract [Objective] To analyze the chemical constituents of effective components of Inula cappa. [Method] The main chemical constituents were characterized by UHPLCQTOFMS， and the characteristic and representative chemical constituents were identified by comparing with the standard material. [Results] Twelve compounds were identified in the active components of Inula cappa， namely chlorogenic acid， neochlorogenic acid，cryptochlorogenic acid， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid B， isochlorogenic acid C， cinarine，luteolin7glucoside， scopolin， luteolin7OβDGlucose（6→1）αLRhodiosin，luteolin7OβDGlucose，apigenin7OβDglucoside. [Conclusion] The twelve compounds in the active components of Inula cappa were identified， which provided the basis for the selection of the quality control index components of Inula cappa.

Key words Inula cappa；UHPLCQTOFMS；Chemical constituents

基金项目国家自然科学基金项目（81360680）；贵州省优秀青年科技人才培养项目（黔科合人字〔2015〕11号）；贵州省民族药药效物质基础研究科技创新人才团队（黔科合平台人才〔2016〕5613）；贵州省高层次创新型人才培养（百层次黔科合平台人才〔2016〕 5677）；贵州省科技合作计划项目（黔科合LH字〔2015〕7362）。

作者简介巩仔鹏（1985—），男，安徽界首人，副教授，博士，从事中药药代动力学研究。

*通讯作者，教授，硕士生导师，从事中药药效物质基础及新药开发研究。

收稿日期 2017-08-30

羊耳菊為菊科植物羊耳菊[Inula cappa（Buch.-Ham.ex D.Don）DC.]的干燥全草，又名山白芷、白牛胆、见肿消，其性辛、微苦，具有解毒、散热、祛风痰等作用，主要用于治疗咽喉肿痛、感冒发热等。羊耳菊为贵州省少数民族常用药物，以全草或根茎入药，其具有良好的抗菌、抗炎等药用价值，所以多种中成药把羊耳菊作为主要的原料药，如莲菊感冒胶囊、菊黄上清含片等，羊耳菊还作为主药入药于贵州省百灵制药的双羊喉痹通颗粒中，该产品已上市且取得良好的销量纪录[1-4]。关焕玉等[5]对羊耳菊进行了许多研究，确定羊耳菊药材活性部位的提取方式为60%乙醇提取、D101大孔树脂吸附、60%乙醇洗脱可得活性部位提取物。但羊耳菊基础研究薄弱一直是亟待解决的技术问题，特别是羊耳菊有效组分的化学成分一直未能明确，很难保证羊耳菊及其相关产品的质量和疗效[6]，并已成为制约羊耳菊相关制剂升级换代和产业链做大做强的瓶颈。因此，该研究将运用超高效液相色谱-飞行时间串联质谱（UHPLC-Q-TOF-MS）对该组分的化学成分进行分析，对其中主要的化学成分进行表征，指认其中特征性、代表性的化学成分，并通过对照品进行比对，以期为以后基于有效成分的羊耳菊药材质量控制研究提供合理的化学指标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器。

超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱系统（Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱系统，包括二元泵、在线脱气机、自动进样器、二极管阵列检测器、色谱柱恒温箱、Bruker MicroTOF-Q Ⅱ高分辨质谱仪等）；Allegra 64R台式高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司）；Q-250A-ST超声波清洗器（上海跃进医用光学器械厂）；EL240十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；EL204万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；超纯水机（四川沃特尔科技发展有限公司）。

1.1.2 试材。羊耳菊药材购自贵州龙里县，经过贵州省食品药品检验所中药标本馆馆长李杨主任药师鉴定为菊科植物羊耳菊[Inula cappa（Buch.-Ham.ex D.Don）DC.]的干燥全草。新绿原酸（四川省维克奇生物科技有限公司，含量≥98%，批号150426）；东莨菪苷（上海同田生物技术有限公司，含量≥98%，批号13061422）；绿原酸（北京世纪奥科生物技术有限公司，含量≥98%，批号MUST-11042802）；隐绿原酸（四川省维克奇生物科技有限公司，含量≥98%，批号150922）；洋蓟素（中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，含量≥98%，批号D15-20130213）；木犀草苷（中国食品药品检定研究院，纯度≥98%，批号111720-200602）；异绿原酸B（中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，含量≥98%，批号Y59-20130115）；异绿原酸A（中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，含量≥96.7%，批号111782-201203）；异绿原酸C（中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，含量≥94.1%，批号111894-201102）。

1.1.3 试剂。乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；甲酸（色谱纯，美国TEDIA有限公司）；甲醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；纯净水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备。

分别精密称取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、洋蓟素、木犀草苷、东莨菪苷对照品适量置于10 mL容量瓶中，少量甲醇超声溶解后，用甲醇定容至刻度，制成浓度为0.5 mg/mL的对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备。

称取羊耳菊有效组分浸膏适量，用50%甲醇溶解，制得浓度为0.5 mg/mL，超声溶解后，以15 000 r/min离心10 min 取上清液，即得供试品。

1.2.3 色谱条件。

色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱温45 ℃，流速0.3 mL/min，进样体积2 μL，流动相为0.1 %甲酸水（A）-0.1 %甲酸乙腈（B），按表1中的程序梯度洗脱。

了其中12种化合物。由于提取物中存在着大量结构类似的同分异构体，不但分子式一样，并且有相似的裂解方式，如新綠原酸、绿原酸和隐绿原酸，因此，该试验采用对照品比对，将其区分和进行进一步确认，12种化合物分别为绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、洋蓟素、木犀草苷、东莨菪苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖（6→1）-α-L-鼠李糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。