二丁颗粒的水提醇沉工艺研究

张石宇 宋信莉 刘文 汤瑾 石洪州

摘要 [目的]通过水提醇沉法的正交试验优化中药复方制剂二丁颗粒的制备工艺。[方法]采用药典中的水煎煮法制备中药液，采用醇沉法进行精制，以秦皮乙素的含量和出膏率为评价指标，通过正交试验对浓缩浓度、乙醇浓度、静置时间3个因素进行优化。[结果]影响精制结果的因素为浓缩浓度和乙醇浓度，由于静置时间没有显著差异，又从降低成本及节省时间等方面综合考虑，确定最佳工艺条件为：浸膏浓缩浓度为2 g/mL，乙醇浓度为80%，静置时间为18 h。[结论]试验结果为二丁颗粒的剂型改良提供了理论依据。

关键词 秦皮乙素；水提醇沉法；正交试验；高效液相色谱法

中图分类号 S-3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）29-0003-03

Water Extractalcohol Precipitation Process of Dibutyl Particles

ZHANG Shiyu1，SONG Xinli2*，LIU Wen2 et al

（1. Guizhou Province Hospital of TCM，Guiyang，Guizhou 550002；2. Guiyang College of TCM，Guiyang，Guizhou 550002）

Abstract [Objective] The water extractalcohol precipitation process of dibutyl particles were optimized by orthogonal test. [Method] The pharmacopeia water decoction prepared in solution and alcohol sinking method were adopted to improve the refined. Taking content and extract rate of phenanthrene as the evaluation index， the concentrated sulfate， ethanol concentration and incubation time of alcohol sinking method were optimized by orthogonal test. [Result] The influencing factors of refining the results were enrichment concentration and ethanol concentration. Because there was no significant difference between incubation time， considering cost and save time， the best process conditions were as followed： the extract concentration was 2 g/mL， the ethanol concentration was 80%， and the incubation time was 18 hours. [Conclusion] The results provide reference for 2 d particles reform.

Key words Phenanthrene；Aqueous alcohol sinking method；Orthogonal experiment；High performance liquid chromatography

作者简介 张石宇（1987—），女，贵州遵义人，药师，硕士，从事中药新技术与新制剂研究。*通讯作者，副教授，硕士，从事中药新技术与新制剂研究。

收稿日期 2017-09-08

二丁顆粒是由紫花地丁、蒲公英、板蓝根、半边莲4味药材制成的中药复方制剂，成品性状为棕褐色颗粒；味甜、微苦或味微甜、微苦（无蔗糖）[1]；具清热解毒、利湿退黄的功能，临床用于热疖痈毒、湿热黄疸、外感风热、咽喉肿痛等的治疗[2-3]。二丁颗粒收载于《中国药典》2015版 Ⅰ 部。随着二丁颗粒应用范围的不断扩大，人们对其工艺进行研究十分必要。目前，学者们对二丁颗粒的纯化工艺研究较少，在制备工艺方面，用水煎煮后直接浓缩加辅料制成颗粒，使得服用量较大。二丁颗粒主要测定方中紫花地丁中秦皮乙素的含量，筆者以此作为方中的质量控制标准，采用水提醇沉方法对二丁颗粒进行了准备，并通过正交试验对二丁颗粒的制备工艺条件进行了优化，旨在为二丁颗粒的剂型改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂。WAT-GZ050926CWJ型WATERS高效液相色谱仪（美国WATERS公司）；Diamonsil C18色谱柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；SK8210HP型超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司）；DZF-6210真空干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；AE240微量分析天平（上海梅特勒仪器有限公司）；YP10002电子天平（上海光正医疗仪器有限公司）。甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20130410）；甲醇（重庆川东化工有限公司，批号：20121001）；95%乙醇（重庆川东化工有限公司，批号：20130410）；乙腈（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20130406）；哇哈哈纯净水。

1.1.2 药材。紫花地丁（中国亳州市京皖中药饮片厂，批号：皖20150145）、蒲公英（安徽泰源中药饮片有限公司，批号：皖20160272）、板蓝根（中国亳州市京皖中药饮片厂，批号：皖20100145）、半边莲（中国亳州市京皖中药饮片厂，批号：皖20150145）、秦皮乙素（中国药品生物制品检定所，批号：110741-200506）。根据文献[4]高效液相色谱法测定紫花地丁中秦皮乙素的含量，对紫花地丁进行含量测定，得出安徽亳州的紫花地丁符合药典标准。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备。

1.2.1.1 对照品溶液的制备。取秦皮乙素对照品适量，精密称定，加入甲醇制成浓度为306 μg/mL的溶液，即得对照品溶液。

1.2.1.2 二丁颗粒浸膏粉的制备。取紫花地丁、半边莲、蒲公英、板蓝根各25 g，加水煎煮2次，第1次2.0 h，第2次1.5 h，合并煎液，滤过，浓缩，减压干燥，直至恒重即得干浸膏，将干浸膏粉碎过100目筛，即得浸膏粉。

1.2.1.3 供试品溶液的制备。取“1.2.1.2”浸膏粉0.14 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，称定质量，超声处理（频率50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

1.2.1.4 阴性对照品溶液的制备。按照“1.2.1.2”方法制备缺紫花地丁的浸膏粉，取0.14 g，再按“1.2.1.3”方法制备阴性对照品溶液。

1.2.2 色谱条件。色谱柱：Diamonsil C18柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水-冰醋酸（25∶75∶0375）；检测波长为353 nm；柱温为25 ℃；流速1.0 mL/min；进样量10 μL。理论塔板数以秦皮乙素计不低于3 000。

1.2.3 方法学考察。

1.2.3.1 标准曲线的绘制。分别精密吸取“1.2.1.1”对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，取10 μL注入液相色谱仪，按“1.2.2”色谱条件进行测定，以峰面积（y）为纵坐标、对照品溶液浓度（x）为横坐标绘制标准曲线。

1.2.3.2 精密度试验。精密吸取10 μL同一浓度（30.60 mg/mL）的秦皮乙素对照品溶液，注入高效液相色谱仪中测定峰面积，重复进样6次，按照“1.2.2”色谱条件进行分析。

1.2.3.3 稳定性试验。精密吸取10 mL供试品溶液，室温下放置，分别于0、2、4、6、8、10、12 h各取10 μL注入高效液相色谱仪中测定峰面积。

1.2.3.4 重复性试验。按“1.2.1.3”方法制备6批样品溶液，分别进样，测定峰面积。

1.2.3.5 阴性试验。分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照液各10 μL进行高效液相色谱分析。

1.2.3.6 加样回收率试验。采用加样回收法，精密称取二丁颗粒干浸膏粉约0.08 g（相当于164 μg秦皮乙素）6份，分别精密加入0.54 mL标准品溶液，浓度为306 μg/mL（相当于165.24 μg秦皮乙素标准品），加入25 mL甲醇，称重，超声处理（频率50 kHz）30 min，放冷，补足损失的质量，滤过，制备得6份供试品溶液，各吸取供试品溶液10 μL注入色谱仪中测定。

1.2.4 二丁颗粒的纯化工艺研究。

1.2.4.1 未精制前二丁颗粒的含量测定。按“1.2.1.2”的方法平行制备3份浸膏粉，再按“1.2.1.3”的方法制备得供试品溶液。分别取10 μL供试品与对照品注入液相色谱仪，按“1.2.2”色谱条件测定秦皮乙素含量。同时按“1.2.1.2”的方法平行制备3份浸膏粉，测定浸膏率。

1.2.4.2 純化工艺的正交试验。采用正交法优选秦皮乙素含量高时的醇沉条件，设置3因素3水平正交考察，以秦皮乙素的含量为评价指标，对二丁颗粒纯化工艺进行探讨。因素与水平见表1。

1.2.4.3 二丁颗粒的精制。以样品溶液中秦皮乙素含量和出膏率的综合值作为评价指标进行综合分析，用水提醇沉法对中药复方二丁顆粒进行精制。二丁颗粒纯化浸膏粉的制备：取紫花地丁、半边莲、蒲公英、板蓝根各12.5 g，加水煎煮2次，第1次2.0 h，第2次1.5 h，合并煎液，滤过；取续滤液，根据精制试验正交表和因素水平表，浓缩，待浓缩液冷至室温，慢慢加入乙醇到浓缩液中，边加边搅拌，密封，于3～5 ℃静置冷藏，取出分离除去沉淀，滤液置于水浴锅上蒸发至干，减压干燥即得干浸膏，将干浸膏粉碎过100目筛，即得浸膏粉。供试品溶液的制备：取0.1 g纯化后的二丁颗粒浸膏粉，按“1.2.1.3 ”的方法制备，即得供试品溶液。对照品溶液的制备：按“1.2.1.1”的方法制备浓度为15.4 μg/mL的对照品溶液。取上述所得样品各10 μL，注入液相色谱仪，按“1.2.2”色谱条件测定秦皮乙素含量。

2 结果与分析

2.1 方法学的考察

2.1.1 标准曲线和线性范围。以峰面积（y）为纵坐标、对照品溶液浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为 y=34 752x-17 057，r=0.999 7，表明对照品溶液浓度为6.12～30.60 mg/mL时线性关系良好。

2.1.2 精密度。重复进样6次，峰面积标准偏差均小于2.0%，相对标准偏差为0.67%，表明精密度良好。

2.1.3 稳定性。相对标准偏差为1.17%，小于3.00%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.1.4 重复性。相对标准偏差为1.41%，小于3.00%，表明试验重复性较好，方法可靠。

2.1.5 阴性试验。结果表明，在秦皮乙素的保留时间处无色谱峰，说明对测定无干扰。秦皮乙素对照品、二丁颗粒阴性对照品和二丁颗粒供试品的HPLC图谱分别见图1、2、3。

2.2 二丁颗粒的纯化工艺研究

2.2.1 未精制前二丁颗粒的含量测定。由表3可知，未精制的二丁颗粒浸膏粉中秦皮乙素的含量为2.049 mg/g，相对标准偏差为2.40%。由表4可知，未精制的二丁颗粒的浸膏得率为21.400 9%，相对标准偏差为0.68%。

2.2.2 纯化工艺的正交试验优化。由表5和方差分析结果可知，影响精制结果的因素为浓缩浓度（A）和乙醇浓度（B），当试验为A3B3时，即浸膏浓缩浓度为2 g/mL、乙醇浓度为80%时，秦皮乙素的平均含量最高，浸膏出膏率最低。由于C没有显著性差异，从降低成本及节约时间等综合考虑，最佳工艺条件定为A3B3C1，即浸膏浓缩浓度为2 g/mL、乙醇浓度为80%、静置时间为18 h。

3 结论与讨论

中药复方提取效果直接关系到产品的质量和疗效，选择评价提取工艺优劣的评价指标是研究工作中的重要问题，合理的提取工艺评价指标应该是提取的有效成分质和量的代表，也是提取物临床作用性质和强度的代表[5]。该研究中，方法学考察是参照2015版药典一部中二丁颗粒的含量测定法所建立。结果表明，秦皮乙素在浓度为6.12～30.60 μg/mL时具有良好的线性关系，相关系数r=0.999 7；平均回收率为102.28%；样品溶液在12 h内保持稳定，相对标准偏差为1.17%。该法稳定，为二丁颗粒制备工艺优选提供了依据。

选择适宜密度的醇沉乙醇浓度和浸膏初始密度对醇沉

的效果有重要影响，若密度或濃度过高，因水煮液中含有较

多的糖类，易包裹药液，可造成有效成分损失；若浓度或密度过低，则药液量较大，需消耗大量乙醇，延长工序时间，有效成分也易被破坏[6]。该研究通过正交试验筛选出最佳的浓缩浓度、乙醇浓度和静止时间，对二丁颗粒进行精制，为后期二丁颗粒的制备工艺奠定了基础。

参考文献

[1]

国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：化学工业出版社，2015：435.

[2] 贾红慧，袁洁，勾倞，等.二丁颗粒的抑菌抗炎和免疫调节作用[J].华西药学杂志，2006，21（5）：453-456.

[3] 葛林，李艳.二丁颗粒治疗急性咽炎肺胃实热症的疗效观察[J].陕西中医，2010，31（9）：1125-1126.

[4] 陈胡兰，汤沛然，张梅，等.高效液相色谱法测定紫花地丁中秦皮乙素的含量[J].成都中医药大学学报，2007，30（3）：57-60.

[5] 谢秀琼.对中药制剂工艺研究评价指标的浅见[J].中药新药与临床药理，1999，10（4）：197-198.

[6] 包汝潑，崔正华，宋宏骞.养阴清肺片的水提醇沉工艺研究[J]. 海峡药学，2012，24（11）：19-21.