巴西橡胶树生长素响应HbJAR1基因克隆与表达分析

李晓娜 肖厚贞 万三连 张冬 张宇

摘 要 JAR1基因是植物生长素响应基因，具有维持植物体内生长素浓度动态平衡和增强植物抗逆性的功能。为了阐明巴西橡胶树中JAR1基因的结构与功能，本研究利用Q-PCR 技术在橡胶树CATAS7-33-97叶片中扩增了JAR1基因，其推导氨基酸含有JAR1蛋白特征性的GH3 superfamily结构域，无信号肽，无跨膜区域，定位在细胞质中，命名为HbJAR1。表达分析结果表明：该基因在橡胶树叶片中的表达量受光照强度、机械伤害和白粉菌侵染显著上调，吲哚乙酸（IAA）、茉莉酸（JA）、乙烯利（ET）、脱落酸（ABA）和赤霉素（GA3）对HbJAR1在橡胶树中的表达也起到不同程度的上调作用。表明HbJAR1基因属于植物JAR1家族，与橡胶树对光照、伤害等逆境响应有关。

关键词 巴西橡胶树；HbJAR1；基因克隆；生物信息学；表达分析

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Gene Cloning and Expression Analysis of Auxin

Responsive HbJAR1 in Rubber Tree

LI Xiaona1， XIAO Houzhen3， WAN Sanlian4， ZHANG Dong2， ZHANG Yu2 *

1 Institute of Scientific and Technical Information， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China

2 Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bio-resources / College of Tropical Agriculture

and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

3 College of Materials and Chemical Engineering， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

4 Sanya City Modern Agricultural Inspection and Warning Center for the Prevention and Control， Sanya， Hainan 572000， China

Abstract JAR1， a auxin response gene， maintains dynamic balance of auxin concentration in plant， strengthens plant tolerance ability stress. To clarify the gene structure and function of JAR1 in rubber tree（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）， HbJAR1 gene was cloned in the leaves of rubber tree CATAS7-33-97 by RT-PCR. The deduced amino acid of HbJAR1 protein has special GH3 superfamily domain structure， no signal peptide， no transmembrane region， located in the cytoplasm. The gene expression of HbJAR1 in the leaves of rubber tree was significantly affected by light intensity， mechanical wounding and powdery mildew infection. IAA， GA3， ET， JA and ABA treatments also induced HbJAR1 expression at different levels. The results suggested that HbJAR1 is a member of plant JAR1 gene family， involved in stress response such as light and wounding signal in rubber tree， etc.

Key words Hevea brasiliensis Müll. Arg.； HbJAR1； gene clone； bioinformatics； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.017

JAR1（JASMONATE RESISTANT 1）基因是植物生長素早期响应基因之一，这类基因与植物的生长发育密切相关[1]。JAR1基因最先在大豆中发现，随后又陆续在大豆、拟南芥、水稻、葡萄、桃、高粱、桑树、白杨以及苜蓿等多种植物中发现了相应的JAR1基因[1-4]。到目前为止，模式植物拟南芥中已发现20个JAR1基因，编码蛋白的分子量大约65～70 ku，其蛋白的氨基或羧基端有保守的CC结构域（Coiled-coil domains）[5]。JAR1基因在植物生长素信号途径、光信号途径以及植物的防卫反应中都起着重要的作用。拟南芥JAR1蛋白具有一种或多种植物生长素的氨基酸合成酶活性[2]。除了拟南芥具有这一功能外，其他植物中的JAR1蛋白也被陆续证明具有此类功能。同时，拟南芥JAR1蛋白在维持植物生长素动态平衡以及光信号传导途径的过程中也具有重要的作用[6]，还参与茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）介导的植物防卫反应。但该功能的研究目前主要集中在拟南芥的少数几个JAR1基因中[5]。

橡胶树作为生产天然橡胶的最主要来源。在中国非传统植胶区，橡胶树生长和乳胶产量会在不同程度上受到割胶、白粉菌等环境条件的影响。例如，干旱导致了橡胶树病虫害发生率和死皮率的增加，还增加了灾害预报和管理的成本[7-8]，降低了橡胶树胶乳产量[9]，严重时会导致橡胶树植株死亡[10]。白粉病作为橡胶树的重要病害之一，会造成巨大的经济损失[11]。尽管植物JAR1基因在植物生长发育和抗逆机制具有重要作用，但在橡胶树中研究甚少。本研究克隆了橡胶树叶片中的JAR1基因，研究其结构和功能，为阐明其在橡胶树抗病等逆境响应中的作用打下良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

采集海南大学热带农林学院教学基地巴西橡胶树品种热研7-33-97叶片作为试验材料，提取总RNA。选取顶篷叶片处于稳定期且2蓬叶均匀一致的热研7-33-97芽接苗进行光照强度、机械伤害、白粉菌侵染和5种激素[吲哚乙酸（IAA）、茉莉酸（JA）、乙烯利（ET）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）]处理[12]。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取以及cDNA的合成 橡胶树胶乳和不同处理下叶片总RNA的提取方法参照Qin等[12-13]，RNA中残留的少量的DNA利用DNase I去除，采用紫外分光光度计测定所得RNA的OD230、OD260、OD280吸收值和OD260/OD230、OD260/OD280的比值，并计算总RNA浓度及其纯度。同时RNA的完整性检测采用1%甲醛变性胶电泳进行。利用RNA反转录试剂盒（TaKaRa，大连）说明书进行cDNA合成。

1.2.2 橡胶树胶乳JAR1部分序列的EST克隆

根据NCBI搜索的EST序列，采用primer 6.0软件设计基因特异引物HbJAR1-F1（5′-CAATGTGG

CGTATGTTAGAA-3′）和HbJAR1-R1（5′-ATTACTGC

GGTAGGTCTTG-3′），以反转录的cDNA为模板，进行巴西橡胶树JAR1基因的cDNA序列扩增。PCR扩增使用2×Taq PCR Master Mix（天根生化），反应体系为：cDNA 1 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，加ddH2O至20 μL。PCR扩增程序为：94 ℃变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，凝胶回收纯化，并克隆到pMD18-T载体上，经菌落PCR检测，送测序[14]。

1.2.3 巴西橡胶树JAR1基因结构分析 序列比对采用DNAMAN6.0软件，ORF筛选采用DNAstar软件，结构域分析采用NCBI Blastp软件和PROSITE，理化性质分析采用Expasy的ProtParam，采用MEGA6.06软件通过neighbor-joining方法构建系统进化树[15]。信号肽采用SignalP分析[16]，跨膜结构域采用TMpred和TMHMM分析，细胞定位采用PSORT，Mitoprot和TargetP分析。

1.2.4 巴西橡胶树JAR1基因表达分析 白粉菌处理，采用Wang等[17]方法；植物激素处理，将顶端胚芽鞘（10 mm）置于KPSC缓冲液（10 mm磷酸钾，pH值6.0，2% 蔗糖，50 μmol/L氯霉素）中培养16 h，去除内生植物生长激素，再将其转移到5种处理的激素中，在处理后0、0.5、1、3、6、12、24 h收集样品；光照处理分别在100、200、400、1 000 μmol/（m2·s）光强下处理，采集不同处理下的叶片，并将它们立即置于-80 ℃冷冻保存。最后用设计好的荧光定量引物FHbJAR1F：ACGCAGGTT ACATTAGTTCT，FHbJAR1R：GGTAGGTCTTGGCA ACATT扩增，以HbACTIN为内参基因，分析HbJAR1的表达量。

1.3 统计分析

采用单因素方差分析和Duncan检验分析，统计分析采用SPSS軟件。采用Origin2015科技绘图软件绘图。

2 结果与分析

2.1 橡胶树HbJAR1基因克隆与生物信息学分析

克隆得到cDNA全长为1 886 bp，将其命名为HbJAR1（基因登录号：JQ060895），5′端非编码区长度为46 bp，3′端非编码区109 bp，编码区1 731 bp，编码576个氨基酸（图1）。分子式为C2 931H4 588N766O868S21，总原子数9 174，推导的氨基酸理论分子量65.1 ku，等电点5.69。根据HbJAR1的cDNA序列推导氨基酸序列与其他植物拟南芥AtJAR1-3（Arabidopsis thaliana，O22190.1）、拟南芥AtJAR1-4（Arabidopsis thaliana，Q9LQ68.1）、拟南芥AtJAR1-12（Arabidopsis thaliana，Q9LYU4.1）、拟南芥AtJAR1（Arabidopsis thaliana，Q9SKE2.2）、水稻OsJAR1-5（Oryza sativa，Q6I581.1）、水稻OsJAR1-12（Oryza sativa，Q53P49.1）相似性分别为35.17%、34.72%、34.2%、63.73%、64.16%、50.57%（图2）。聚类分析结果表明HbJAR1蛋白与水稻家族成员OsJAR1-5相似度最高，聚为一类（图3）。

植物的JAR1含有一个特征性结构域：JAR1 superfamily[pfam03321]。从图4的生物信息学分析可以看出，在图4-A中HbJAR1蛋白具有特征性JAR1 superfamily结构域（从13位到562位氨基酸具有保守性），并与其他JAR1成员高度保守，属于JAR1家族成员。根据TargetP 1.1，Mitoprot和PSORT分析细胞定位发现，HbJAR1蛋白在细胞质、微体、线粒体基质、溶酶体中的几率分别为0.45、0.3、0.1、0.1，表明HbJAR1主要定位在细胞质中（图4-B），无信号肽和跨膜区域。

2.2 HbJAR1基因的表达分析

用不同的光照强度处理橡胶树芽接苗，结果发现HbJAR1在200 μmol/（m2·s）光强下的表达量相对100 μmol/（m2·s）光强下的降低了一倍，但在400 μmol/（m2·s）光强下表达量显著上调，并达到最大值（图5）。说明光照强度会影响HbJAR1的表达，该基因与橡胶树对光照强度的响应有关。

从图6可看出，机械伤害能上调HbJAR1在橡胶树中的表达。在处理叶片后的1～2 h基因的表达量达到最高峰，随后下降，在10 h时，又继续上调，说明HbJAR1与橡胶树对机械伤害响应有关。

白粉菌侵染后，不同级别的叶片中HbJAR1的表达均显著上调，在5、7级叶片中基因的表达量上调到12倍和10倍（图7）。说明白粉病菌侵染会导致HbJAR1基因表达的显著增加。

用乙烯利处理橡胶树叶片，发现在处理后6 h，HbJAR1的表达量开始出现显著的上调现象，而且达到最高峰，是0 h的1.7倍。茉莉酸处理下HbJAR1的表达规律同乙烯利处理一致，也是在6 h出现最高峰，随着处理时间的延长，表达量整体呈下降趋势。而HbJAR1对脱落酸和赤霉素处理的响应速度最快，都是在处理后0.5 h时便开始出现显著的上调现象。所不同的是，在赤霉素处理后的0.5 h，基因的表达量达到最大值，是0 h的30倍；而用脱落酸处理的样品中，基因的表达量在处理后10 h达到最高峰，是0 h的58倍。随着处理时间的延长，赤霉素和脱落酸处理对基因的表达量变化趋势是基本一致的（图8）。用吲哚乙酸处理橡胶树叶片后，在0～2 h时HbJAR1表达量略有下降，到6 h时，表达量开始上升，到48 h时达到最大值，是0 h的3.7倍（图9）。HbJAR1基因受多种激素的诱导显著上调表达，表明HbJAR1可能在激素信号转导过程中具有重要的作用。

3 讨论

关于JAR1基因的结构和功能的研究主要集中在拟南芥等模式植物中。笔者在橡胶树中发现HbJAR1基因编码的蛋白预测的分子量大小为65.1 ku，而拟南芥中大约为65～70 ku。在对HbJAR1的信号肽和跨膜区域的预测分析显示，该蛋白可能不存在信号肽和跨膜区域，这与桑树中MaJAR1.6蛋白相同[3]。辣椒CaJAR1蛋白中也未检测到跨膜区域，该蛋白主要定位在叶绿体内[4]，而橡胶树HbJAR1主要定位于细胞质中。将橡胶树中克隆得到JAR1基因与拟南芥和水稻中的该基因的氨基酸序列进行比对，发现与水稻的相似度达60%以上，并含有特征性结构域。说明HbJAR1是植物JAR1家族成员。

JAR1基因作为植物生长素响应基因，它不但在调节植物体内生长素平衡中起着重要的作用，还能响应其他植物激素，可以通过编码一种生长素-氨基酸结合酶来调节游离植物激素的浓度[18]。所不同的是IAA-amino 的形成造成IAA失活，并抑制生长素信号途径，而JA-amino 的形成却可以激活JA信号途径[1]。目前研究的植物中，拟南芥20个JAR1蛋白中，绝大部分都具有这一功能[19-20]。本研究中，HbJAR1在受到JA诱导时，其表达量出现显著上调。在IAA处理后，处理初期，基因表达量呈下降趋势，直到处理后6 h开始出现上调现象。Hagen等[21]认为在生长素浓度较低时JAR1转录会受到抑制，并不是所有JAR1基因都能响应生长素的处理而出现转录上调，如经生长素处理的拟南芥AtJAR1.9和17并没有出现明显的转录上调，经生长素处理的水稻OsJAR1.9和11反而出现了转录水平下降。在GA3和ABA作用下，HbJAR1在处理早期便出现表达上调的现象。杨树中赤霉素GA3能激活生长素的极性运输从而增加茎干的生长素水平，生长素之间还存在交互作用，而JAR1基因在其中是否起着至关重要的作用尚不明确。JAR1蛋白还参与光信号转导途径，通过影响植物对光的吸收来影响植物的生长发育[6，20]。同时，机械損伤和白粉菌侵染处理都能诱导JAR1基因表达的上调。同样在橡胶树的研究中，这些逆境因素均能引起HbJAR1的上调表达，说明HbJAR1参与橡胶树的逆境调控响应。

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