灵香草总黄酮的提取及对羟自由基的清除效率

闫旭宇 李梦汝 李玲

摘 要 以灵香草为实验材料，利用超声波辅助乙醇提取灵香草黄酮。通过正交试验设计优化灵香草总黄酮的提取条件，并对黄酮提取物的抗氧化性进行研究。结果表明，灵香草黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度70%、料液比1 ∶ 20、提取时间50 min、提取温度60 ℃。在此条件下，灵香草黄酮的平均提取率为3.27%。在相同质量浓度下，所提取的灵香草黄酮提取物对羟基自由基的清除率高于Vc，具有一定的抗氧化能力。

关键词 灵香草；黄酮；提取优化；抗氧化性

中图分类号 Q949.95 文献标识码 A

Extraction of Total Flavonoids from Lysimachia foenum-graecum

Hance and Its Scavenging Capacity on

Hydroxyl Free Radicials

YAN Xuyu1，2， LI Mengru2， LI Ling1 *

1 College of Life Science， Yanan University， Yanan， Shanxi 716000， China

2 Department of Chemistry and Biological Engineering， Hunan University of Science and Engineering / Key Laboratory

of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South， Yongzhou， Hunan 425199， China

Abstract In this experiment， the total flavonoids were extracted from Lysimachia foenum-graecum Hance by ultrasound-assisted ethanol extraction. The extraction conditions of flavonoids were optimized by an orthogonal experimental design， and the antioxidant effects of the extracted flavonoids was also studied. The results showed that the optimum extraction technology was ethanol concentration 70%， solid-liquid ratio 1 ∶ 20， ultrasound-assisted ethanol extraction time 50 min， and the extraction temperature 60 ℃. Under the condition， the extraction rate of flavonoids reached 3.27%. The experiment indicated that the hydroxy radical scavenging rate of the flavonoids was better than Vc under the same quality concentrations.

Key words Lysimachia foenum-graecum Hance； flavonoids； extraction and optimization； antioxidants

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.015

灵香草（Lysimachia foenum-graecum Hance）为报春花科植物的带根全草，又名香草、零陵香，其味甘、性平，具有解表、止痛、行气、驱蛔等功效[1-2]，是特色传统药用植物。灵香草中含有黄酮类化合物、多糖、挥发油、香豆素等成分，其主要功用集中在药用、食品、化妆品和香料[3-6]。黄酮类物质具有较强的生物活性，并具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌消炎、抗衰老等功效[7]。然而，迄今针对灵香草中总黄酮提取工艺的研究报道很少，仅有杨瑞云等[8]研究了乙醇热浸提法的提取工艺，但该法提取物杂质含量较多、提取率较低。利用超声辅助乙醇法来提取黄酮，能加快胞破碎的速度、降低能耗、节省时间，且提取产品的纯度较高[9]。因此，本实验选用超声辅助乙醇提取灵香草总黄酮，通过正交实验优化灵香草总黄酮的提取条件，并对羟基自由基的清除作用进行研究，为灵香草有效成分的提取和新型抗氧化剂的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂 原料：灵香草（购自湖南永州，样品烘干备用）。试剂：无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、抗坏血酸，芦丁标准品，所用试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备 JJ-2型粉碎机，江苏同君科技仪器有限公司；JA3003电子分析天平，上海舜宇恒平科技仪器有限公司；KQ3200E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SHZ-DⅢ循环水真空泵，巩义市予华仪器责任有限公司；WG-71型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验方法 提取工艺流程：灵香草→烘干→粉碎（100 目）→超声辅助乙醇提取（300 W）→减压抽滤→定容→提取液。

芦丁标准曲线的绘制：以芦丁为标准品，在已配置好的不同濃度的标准溶液中，加入Na（NO2）、Al（NO3）3、NaOH溶液，发生显色反应。以不加芦丁对照品溶液为参比，在510 nm处测吸光度，以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程y=5.034x+0.003 5，R2=0.996 5。

灵香草黄酮含量的测定：采用Na（NO2）-Al（NO3）3-NaOH法测定总黄酮[10]。根据回归方程计算出提取液中总黄酮的质量浓度，然后计算灵香草中总黄酮的提取率（%）：

黄酮提取率=C×V×N/M×100%

式中：C为提取液中总黄酮浓度（mg/mL），V为定容体积（mL），N为稀释倍数，M为称量的灵香草质量（g）。

1.2.2 单因素试验设计 通过单因素实验，研究乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度对灵香草总黄酮提取率的影响，确定超声辅助提取黄酮的最佳工艺参数范围。

乙醇浓度对灵香草总黄酮提取率的影响：准确称取干燥的灵香草粉末1.0 g，分别加入20 mL 60%、65%、70%、75%、80%的乙醇溶液，在温度50 ℃，超声时间40 min下，研究乙醇浓度对灵香草总黄酮提取率的影响。

料液比对灵香草总黄酮提取率的影响：准确称取干燥的灵香草粉末1.0 g，在温度50 ℃，超声时间40 min下，分别设定料液比（g/mL）为1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、1 ∶ 30，研究不同料液比对灵香草总黄酮提取率的影响。

时间对灵香草总黄酮提取率的影响：准确称取干燥的灵香草粉末1.0 g，在温度50 ℃，料液比1 ∶ 20下，分别设定超声辅助提取时间为20、40、60、80、100 min，研究不同提取时间对灵香草总黄酮提取率的影响。

温度对灵香草总黄酮提取率的影响：准确称取干燥的灵香草粉末1.0 g，在超声时间40 min，料液比1 ∶ 20下，分别设定提取温度为30、40、50、60、70 ℃，研究不同温度对灵香草总黄酮提取率的影响。

1.2.3 正交实验 在单因素实验的基础上，以乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度为试验因素，选择最佳3个水平，以总黄酮提取率为指标，采用L9（34）正交表进行正交试验，确定超声辅助乙醇提取灵香草总黄酮的最佳工艺条件。

1.2.4 羟基自由基清除实验 灵香草总黄酮及Vc对羟基自由基的清除率，采用水杨酸法[11]进行测定。对羟基自由基的清除率按下式计算：

E=[A0-（Am-An）]/A0×100%

式中，A0为空白对照液的吸光值，Am为加入黄酮后的吸光值，An为不加H2O2时黄酮的吸光值。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度对提取率的影响 由图1可知，随着乙醇浓度的增加，灵香草黄酮提取率逐渐增加。当乙醇浓度为70%时，灵香草黄酮提取率达到最高，之后逐渐下降。这可能是由于乙醇对细胞膜的破坏作用比水强，更易使黄酮类化合物溶出[9]。但是，由于总黄酮中的糖基易溶于水[12-13]，乙醇浓度过高会引起黄酮的溶解度下降，并引起脂溶性物质的溶出量增加，从而导致黄酮类化合物的得率下降。因此，一定比例的乙醇有助于获得较高的提取率。当乙醇浓度为70%时，提取效果较好。

2.1.2 料液比对提取率的影响 由图2可知，随着料液比的增加，灵香草黄酮提取率逐渐提高，当料液比为1 ∶ 20时，灵香草精黄酮提取率最高，之后呈缓慢下降趋势。这可能是由于一定比例的料液比已经可以将黄酮类化合物基本溶出，增大料液比，乙醇水溶液中溶解的黄酮类化合物越多，但是当料液比超过一定值，提取率的增幅将逐渐降低。另外，料液比过大不但会增加溶剂的用量，还会增大去除溶剂所需的负荷。因此，料液比為1 ∶ 20左右为宜。

2.1.3 时间对提取率的影响 如图3所示，随着提取时间增加，黄酮提取率不断增加，在提取时间为60 min时，灵香草黄酮提取率最高，之后逐渐下降。这可能是由于提取时间过短，黄酮类化合物还没有充分溶出，时间过长又导致一些溶剂挥发，或黄酮类化合物可能发生化学反应，使提取物中的有效成分被破坏。同时，随着提取时间延长，溶液中杂质也逐渐增多，也会影响黄酮的浸出。因此，提取时间选择60 min左右为宜。

2.1.4 温度对提取率的影响 如图4所示，随着提取温度升高，黄酮提取率不断增加，在60 ℃时，灵香草黄酮提取率最高，之后提取率缓慢下降。这可能是由于温度升高，分子运动速度加快，黄酮类化合物更容易浸出，但是温度过高，容易导致黄酮类化合物的结构被破坏，造成黄酮含量降低。因此，提取温度应控制在选择60 ℃左右为宜。

2.2 正交实验结果

根据单因素试验结果，以乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度为考察因素，以提取率为考察指标，进行L9（34）正交试验，因素水平表见1。

由表2的极差值大小可知，影响灵香草黄酮提取率的主次因素依次为乙醇浓度（A）>提取时间（C）>提取温度（D）>料液比（B），乙醇浓度对提取率的影响相对较大。超声辅助乙醇提取灵香草黄酮的最佳组合为A2B2C2D2，即乙醇浓度70%，料液比为1 ∶ 20，提取时间为50 min，提取温度60 ℃。在此条件下进行验证实验，最终得到灵香草精油的提取率为3.27%。

2.3 灵香草黄酮对羟基自由基的清除作用

由图5可知，在一定范围内，灵香草总黄酮提取物和Vc对羟基自由基清除率均逐渐增强，说明黄酮提取物和Vc对羟基自由基的清除能力存在着一定的量效关系。在相同质量浓度下，灵香草黄酮提取物对羟基自由基具有较好的清除作用，效果明显高于Vc。

3 讨论

目前，由于食品常用抗氧化剂具有毒性，许多国家已经停止或严格限制其使用，寻找开发无毒的天然抗氧化剂已经引起广泛重视。黄酮类化合物广泛存在于植物体内，具有重要的生理活性。本实验在超声辅助乙醇提取的最优条件下，即乙醇浓度70%，料液比为1 ∶ 20，提取时间为50 min，提取温度60 ℃时，灵香草黄酮的提取率为3.27%，远高于杨瑞云等[8]利用乙醇热浸提法提取灵香草总黄酮的提取率（0.98%）。超声辅助乙醇法适宜于在低耗能、省时间的情况下提取灵香草黄酮类物质。

羟基自由基能杀死机体红细胞，降解蛋白质、细胞膜和多糖化合物，造成遗传分子的损伤，导致机体衰老，诱发心脑血管疾病、糖尿病、痴呆症，甚至诱发肿瘤等多种疾病及其并发症[14]。研制经济有效的天然黄酮类抗氧化剂是防治上述疾病的重要途径[15-17]。研究表明，金银花、碱蓬等[18-19]的黄酮均具有较强的抗氧化能力。本实验中，在相同质量浓度下，灵香草黄酮提取物的羟基自由基清除率高于Vc，具有较好的抗氧化活性，可以作为一种羟基自由基的清除剂进行应用。因此，本研究对灵香草资源的开发利用提供有力依据，为寻找天然抗氧化剂具有重要意义。

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