10种南药植物提取物乙酰胆碱酯酶抑制活性的筛选模型研究

丁运华 郭少敏 刘燕 郑建灵

摘 要 采用筛选模型对10种南药样品乙酸乙酯提取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性进行了评价。结果表明：10种南药（益智、鸡血藤、决明子、巴戟天、溪黄草、金樱子、化橘红、佛手、绞股蓝、五指毛桃）均具有不同程度的乙酰胆碱酯酶抑制活性。当提取物浓度为1.0 mg/mL时，溪黄草、益智、化橘红、绞股蓝、五指毛桃表现出较强的抑制活性，平均抑制率大于50%，分别为89.59%，77.10%，67.54%，52.62%，52.29%，其他5种南药的平均抑制率在20.81%～49.81%之间；提取物浓度为0.1 mg/mL时，溪黄草、益智、佛手仍表现出相对较强的抑制活性，平均抑制率大于25%，其他7种南药的平均抑制率在6.07%～24.78%之间。应该深入研究复方中药治疗老年痴呆的药效物质基础，加大对南药资源的开发利用。

关键词 南药；乙酰胆碱酯酶；抑制活性；筛选模型

中图分类号 TQ041 文献标识码 A

Evaluation of Acetylcholinesterase Inhibitory Activity

of 10 Southern Chinese Herbs by Screening Model

DING Yunhua， GUO Shaomin， LIU Yan， ZHENG Jianling

School of life Science， Huizhou University， Huizhou， Guangdong 516007， China

Abstract In the present study， AChE activity of ethyl acetate-soluble fractions from 10 southern Chinese herb samples were screened by a screening model. The results indicated that all these 10 samples exhibited AChE inhibitory activities. At 1.0 mg/mL of extracts concentrations， higher inhibitory activity appeared in Rabdosia serra （Maxim.）Hara， Alpinia oxyphylla， Citrus grandis cv. Tomentosa， Gynostemma pentaphyllum， and Radix Fici Hirtae， with inhibition ratios of 89.59%， 77.10%， 67.54%， 52.62%， and 52.29%（all of the above more than 50%）respectively， and the inhibition ratios of the other 5 samples at this concentration were between 20.81% and 49.81%. At 0.1 mg/mL of extracts concentrations， Rabdosia serra（Maxim.）Hara， Alpinia oxyphylla， Citrus medica L. and var. sarcodactylis Swingle demonstrated higher inhibitory activites， with average inhibition ratios more than 25%， while the inhibition ratios of the other 7 samples at this concentration were between 6.07% and 24.78%. Exploring of southern Chinese herbs should be strengthened in searching components for treatment of Alzheimers Disease.

Key words Southern Chinese herb； acetylcholinesterase； inhibitory activity； screening model

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.013

阿尔茨海默氏病（Alzheimers Disease，AD） 又称早老性痴呆症，是一种以记忆、判断和思维等存在认知功能障碍以及人格和行为严重改变为主要特征的慢性神经退行性疾病。随着世界人口老龄化进程的加快，AD病发病率在国内外呈现不断上升的趋势，AD 已成为继心脑血管疾病和癌症之后威胁老年人生命健康的严重疾病之一。AD的发病机制复杂，目前多方面研究表明，AD患者大脑内神经递质—乙酰胆碱的缺失是导致AD疾病的关键原因[1-5]，AD的病理与患者神经间隙中乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）活性过高具有重要关系。因此乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEI）药物是目前研究最多、使用最为广泛的抗早老性痴呆症药物[3-6]。

中国药用植物资源极其丰富，是开发乙酰胆碱酯酶抑制剂的宝库。大量研究发现，许多海藻[3]、蕨类[6]、中草药[5，7]等天然植物都有乙酰胆碱酯酶抑制活性。如药理研究表明石杉碱甲、黃皮酰胺对轻中度早老性痴呆有一定的治疗作用[3]。从天然资源中寻找AChEI一直是研究的热点领域。华南地区中草药资源蕴藏量大，用药历史悠久，疗效显著，成为中国医药学的重要流派。南药中的巴戟天、益智、化橘红、佛手、五指毛桃、溪黄草、鸡血藤、决明子、金樱子等都是华南地区常用的药用植物[8-10]。为了更好地开发利用南药资源，寻找来源于南药资源的乙酰胆碱酯酶抑制剂，本研究基于Ellman方法[11]，设计筛选模型，对10种南药（溪黄草，决明子，巴戟天，鸡血藤，金樱子，茨实，五指毛桃，绞股蓝，益智，佛手）95%乙醇提取物的乙酸乙酯组分进行活性筛选，为筛选高效安全的天然乙酰胆碱酯酶抑制剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 溪黄草、巴戟天、五指毛桃、绞股蓝、益智、佛手、化橘红、决明子、鸡血藤、金樱子等10种南药购于惠州同仁堂药店，经惠州学院生命科学学院林芳花副教授鉴定。

1.1.2 试剂与仪器 碘化硫代乙酰胆碱（ATCI，由国药集团化学试剂有限公司进口分装，用50 mmol/L、pH8.0的PBS溶液配制），二硫代双对硝基苯甲酸（DTNB，由国药集团化学试剂有限公司进口分装，用50 mmol/L、pH7.0的PBS溶液配制），乙酰胆碱酯酶（Sigma产品，10 mg酶加入1 mg牛血清白蛋白作为稳定剂，用1 mL 50 mmol/L、pH8.0的PBS溶液溶解，制成2 U/mL的酶液），他克林（tacrine，Sigma公司，用50 mmol/L、pH8.0的PBS溶液配制），其余试剂为国产分析纯或生化试剂规格。

723E型可见分光光度计（天津科纳斯光学分析仪器有限公司），DZF-6020型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），RE2000A旋转蒸发仪（上海一科仪器有限公司），DK-8B型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）

1.2 方法

酶促反应体系（筛选模型）的建立：参照Ellman的方法稍作改进[11]。Ellman的方法是测定AChE活性最常用的方法，其原理为AChE催化水解底物碘化硫代乙酰胆碱（ATCI），水解形成的产物碘化硫代乙酰胆碱迅速与显色剂二硫代双硝基苯甲酸（DTNB）反应生成黄色产物5-巯基-2硝基苯甲酸，该产物在412 nm处有光吸收。在酶催反应的稳态阶段用光吸收值OD值表征酶促反应初速度。

1.2.1 非酶促水解光吸收 由于底物ATCI不稳定，在储存及水浴过程中容易发生非酶催水解产生碘化硫代乙酰胆碱，其与显色剂DTNB结合产生光吸收[11]。因此在测酶活之前，需测定ATCI非酶催水解产生的光吸收，排除背景干扰，计算真正由酶催反应所产生的光吸收值。

取pH8.0、50 mmol/L的 PBS 2 730 μL于试管中，依次加入15 mmol/L的DTNB 100 μL，15 mmol/L ATCI 100 μL，不加酶，分别于37 ℃水浴反应不同时间（0，5，10，15，20，25，30 min）；加入100 μL 1%的SDS终止反应，测其在412 nm处的光吸收值OD值，这就是底物ATCI的非酶催水解光吸收值。

1.2.2 OD-t曲线的绘制 取pH8.0、50 mmol/L 的PBS 2 730 μL于试管中，依次加入乙酰胆碱酯酶13 μL、15 mmol/L的DTNB 100 μL、15 mmol/L 的ATCI 100 μL，分别于37 ℃水浴反应不同时间（0，5，10，15，20，25，30 min）；加入100 μL 1%的SDS终止反应，测其在412 nm处的OD值，该实验用于确定酶催反应处于稳态的时间[3]。

1.2.3 OD-酶量（酶浓度）曲线的绘制 取pH8.0、50 mmol/L的PBS 2 730 μL，再依次加入不同濃度（0.8，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8 U/mL）的乙酰胆碱酯酶13 μL、15 mmol/L的DTNB 100 μL、15 mmol/L的ATCI 100 μL，分别于37 ℃水浴反应20 min（由1.2.2确定的时间），测其在412 nm处的OD 值。该实验用于确定是否可以用OD值表征酶活。

1.2.4 1/OD-1/[S]双倒数曲线的绘制 根据1.2.2确定的稳态反应时间，20 min内的OD-t曲线具有良好的线性关系，故在此时间内可用OD值表征反应速度v，同理可用1/OD-1/[S]曲线代替1/v-1/[S]曲线以探讨乙酰胆碱酯酶的性质，并验证其是否符合米氏方程。

取pH8.0、50 mmol/L的 PBS 2 730 μL，加入2 U/mL的乙酰胆碱酯酶13 μL、15 mmol/L的DTNB 100 μL，再分别加入不同浓度（7.5，3.75，2.5， 1.875，1.5，1.25 mmol/L）的ATCI 100 μL，分别于37 ℃水浴反应20 min，加入100 μL 1%的SDS终止反应，测其在412 nm处的OD值。

1.2.5 样品的制备 取10种中药样品置于干燥箱中以60 ℃干燥24 h，分别称取30 g，粉碎；用600 mL 95%的乙醇溶液分3次浸泡，以50 ℃超声提取30 min，合并提取液，减压浓缩，得乙醇提取物；取乙醇提取物，加适量水分散，用600 mL乙酸乙酯分3次萃取，合并萃取液，减压浓缩，得到乙酸乙酯提取物（膏状物），测定活性时再用50%的乙醇溶液分别将其溶解成1.0 mg/mL和0.1 mg/mL的样品溶液。

1.2.6 活性测定及计算 取PBS（pH8.0，50 mmol/L）2 650 μL、样品100 μL、乙酰胆碱酯酶13 μL、15 mmol/L的DTNB 100 μL、15 mmol/L的ATCI 100 μL，于37 ℃水浴反应20 min，加入100 μL 1%的SDS终止反应，测其在412 nm处的OD值，记为A样品。

由于中药样品本身多有颜色，所以每个样品同时做一个本底扣除，在上面的测定中，用100 μL 50 mmol/L的PBS代替底物溶液，测其在412 nm处的OD值，记为A本底。

空白对照用100 μL PBS来代替样品，测其在412 nm处的OD值，记为A空白。

阳性对照：测定方法同A样品，反应体系中用100 μL的他克林代替样品溶液。

吸光值和抑制率的计算公式为：

样品真实吸光值（A真实）为：A真实=A样品-A本底

样品抑制率（I）为：I=（A空白-A真实）/A空白×100%

所有实验重复3次，并计算平均值和标准偏差。

2 结果与分析

2.1 非酶催反应的光吸收

由图1可以看出，ATCI在水浴条件下的吸光值随着水浴时间的延长而增加，OD-t成线性关系，表明ATCI的非酶催吸光值不可忽略。

2.2 OD-t曲线确定稳态反应时间

由图2可看出，本实验的酶反应体系在反应开始后的20 min内线性关系较好，反应处在稳态阶段，因此可以取20 min作为该反应体系的反应时间，此段时间内的OD412值可表征酶催反应的反应速率。

2.3 OD-酶活曲线

从图3可以看出，在20 min的反应时间范围内，酶浓度为0.8～2.8 U/mL时，酶浓度和OD值呈现良好的线性关系，因此在此范围内可以用OD值来表征酶活。

2.4 1/OD-1/[S]曲线

从图4可以看出，在本实验范围内1/OD与1/[S]成正比，即反应速度倒数与底物浓度倒数之间符合线性关系，说明本实验中的Sigma乙酰胆碱酯酶为米氏酶，符合米氏方程：

v=Vmax[S]/（Km+[S]）

2.5 南药提取物的AChE抑制活性

依据1.2.5的样品制备方法得到2种浓度的样品溶液：1.0 mg/mL和0.1 mg/mL， 以Sigma乙酰胆碱酯酶为酶源，采用1.1.2的方法配制成酶液，按照1.2改良的Ellman方法及筛选模型，利用1.2.6的抑制率计算公式，得到10种南药乙酸乙酯提取物在2种浓度（1.0，0.1 mg/mL）时的乙酰胆碱酯酶抑制活性，结果见表1。结果表明，在提取物浓度为1.0 mg/mL和0.1 mg/mL时，10种南药均具有一定的乙酰胆碱酯酶抑制活性。其中，提取物浓度为1.0 mg/mL时溪黄草、益智和化橘红表现出较强的抑制活性，平均抑制率分别达到89.59%、77.1%和67.54%；五指毛桃和绞股蓝的平均抑制率都在52%；鸡血藤和佛手的平均抑制率接近50%；金樱子和决明子的平均抑制率都在40%；巴戟天的平均抑制率在选取的10种南药中最低，为20.81%。当提取物浓度为0.1 mg/mL时，所有10种南药仍具有一定的抑制活性，其中益智的抑制活性最高，平均抑制率为48.04%；其次是溪黄草，平均抑制率为30.78%；佛手、五指毛桃、鸡血藤和决明子等4种南药的平均抑制率都在20%以上；化橘红的平均抑制率为19.69%，接近20%；金樱子和巴戟天的平均抑制率在10%以上；绞股蓝的平均抑制率最低，为6.07%。

3 讨论

治疗AD目前最有效的方法是应用乙酰胆碱酯酶抑制剂，寻找安全毒副作用小、选择性强的药物，目前公开的主流方法均由Ellman法改进而来[3，5，12]。本研究首次运用基于Ellman法的筛选模型，对10种南药植物进行乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选，结果表明，溪黄草、益智、化橘红、佛手、五指毛桃、鸡血藤、绞股蓝、决明子、巴戟天、金樱子等10种南药均表现出一定的抑制活性，其中溪黄草、益智、化橘红、佛手、五指毛桃等5种南药在1.0 mg/mL和0.1 mg/mL 2种不同的提取物浓度下都表现较强的抑制活性。研究结果可以为筛选高效、安全的乙酰胆碱酯酶抑制剂提供新线索。

南药在用于预防和治疗老年性痴呆等方面已经有一些报道。胡增峣等[13]通过研究132首与老年痴呆有关的中药复方，发现益智、巴戟天、鸡血藤，决明子、化橘红等5种南药已作为复方中药的配伍组成用于治疗老年痴呆症。佛手作为益智聪脑颗粒的配方能改善老年痴呆患者的总体功能[14]。五指毛桃与熟地黄、何首乌、黄精等组成的中药制剂具有镇静安神、宁心益智的作用[15]。梁宏宇等[16]研究发现巴戟天胶囊对血管性痴呆患者的智能改善有一定疗效。以上大部分应用停留在中药复方配伍的水平上，对于其中药效的物质基础尚不清楚。刘学贵等[17]发现金樱子的醇提取物对预防老年痴呆症有一定的作用。石绍淮等[18]的研究發现益智正丁醇提取物可促进老年痴呆模型小鼠学习记忆能力的改善。金虹等[19]发现益智的乙醚提取物有较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性，这与本研究结果比较接近，在提取方法上稍有不同。关于溪黄草和绞股蓝在预防和治疗老年性痴呆方面的应用尚未见报道。本研究发现溪黄草具有很强的乙酰胆碱酯酶抑制活性，在选取的10种南药中排在首位；绞股蓝的乙酰胆碱酯酶抑制活性在决明子、巴戟天和金樱子之上。因此，很有必要对这些中草药进行进一步的研究，揭示南药预防和治疗老年性痴呆的药效物质基础，从中发现活性更强的有效成分，从而为防治早老性痴呆症的药物研究提供有价值的活性先导结构。

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