园龄对可可苗期生长及其根际土壤环境的影响

赵溪竹 林兴军 白亭玉 王丽萍 赖剑雄 赵青云

摘 要 可可是世界最重要的多年生經济作物之一，为了揭示不同园龄可可园土壤演变规律，为其可持续生产提供依据。以休耕地为对照（CK），研究低龄（4 a）、中龄（12 a）和老龄（32 a）3种不同园龄土壤培育可可苗期生长及其与根际土壤有机碳（SOC）含量、土壤酶活性和微生物区系等关系。结果表明，32 a园龄土壤培育可可苗生物量显著高于4 a、12 a和CK，分别增加了89.15%、29.24%和28.03%；32 a和12 a园龄处理根际SOC含量显著高于4 a园龄，老龄园有利于SOC的积累；随着园龄增加，脲酶活性增加，且与SOC含量极显著正相关，12 a和32 a园龄土壤脲酶活性分别比CK显著增加了44.36%和43.11%；12 a园龄处理根际土壤中可培养细菌数量减少，真菌数量则显著增加，12 a土壤可培养真菌数量分别是4 a、32 a和CK的3.04、1.46和3.23倍，园龄可能导致土壤微生物区系变化。综上所述，随着土壤园龄增加，可可苗生物量、根际SOC含量和脲酶活性均增加，根际土壤微生物区系发生变化，根际土壤真菌数量与SOC含量、脲酶活性极显著正相关，可可根际SOC含量是光合作用、植株生长、土壤酶活性和土壤微生物共同作用的结果。

关键词 园龄；根际；土壤微生物；土壤酶活性；可可

中图分类号 S571.3；S-3 文献标识码 A

Effect of Planting Age on Theobroma cacao Seedling Biomass

and Rhizosphere Soil Environment

ZHAO Xizhu， LIN Xingjun， BAI Tingyu， WANG Liping， LAI Jianxiong， ZHAO Qingyun*

Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Genetic

Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract Cocoa is one of the most important perennial cash crops worldwide. Our aim was to analyze the development laws of soil quality， provide the basis for promoting sustainable production. Comparing seedling biomass， soil organic carbon（SOC）content， enzyme activities， rhizosphere microorganism population quantifies and their relationships of 4 years， 12 years and 32 years soil of cocoa plantations. Short fallow was used as treeless references（CK）. The main results obtained were as follows： The seedling biomass were significantly increased by 89.15%， 29.24% and 28.03% in soil of 32 years compared with that of 4 years， 12 years and CK， respectively. The SOC content was significantly increased in soil of 32 years and 12 years compared with that of 4 years， and aging was conductive to the accumulation of SOC. As the planting age increased， soil urease activities increased， which was extremely significantly positive correlation with the SOC content. Soil urease activities of 12 and 32 years obviously increased by 44.36% and 43.11%， respectively compared with that of CK. The culturable bacteria in rhizosphere soil decreased， and the culturable fungi significant increased. The culturable fungi number in 12 years soil were 3.04， 1.46 and 3.23 times higher compared with that in 4 years， 32 years and CK， respectively. Planting age may lead to changes of soil microflora. In conclusion， with the increase of planting age， the seedling biomass， rhizosphere SOC content and soil urease activities were increased， and the soil microflora changed. The culturable fungi in rhizosphere soil was significantly positively related to SOC content and urease activities. The SOC content in rhizosphere soil was the result of photosynthesis， seedlings growth， enzyme activities and microorganism.

Key words planting age； rhizosphere； soil microbes； soil enzyme activity； Theobroma cacao

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.009

可可（Theobroma cacao L.）是世界三大饮料作物之一，梧桐科多年生常绿小乔木，具有极高的经济价值，是制作巧克力的主要原料，也是饮料、糖果的重要配料[1]。可可是典型的热带经济作物，广泛种植于世界70多个国家和地区，据国际可可组织（ICCO）统计，2014/2015年度世界可可总产量约420万t[2-3]，预计到2020～2025年，可可产量再增加100万t才能满足消费者的需求[4]。可可在我国海南、云南、台湾等地有规模化种植[5]。随着人们生活水平的提高，对可可原料的需求量也不断增长[6]。由于对施肥等养分管理缺乏认知或为了减少投入，许多非洲可可主产国的农户对可可园管理粗放，甚至不施肥[7]，导致种植20～30年甚至更短的时间，可可园出现土壤矿质养分失衡，土壤退化，树体衰老，易受病虫危害[8]。也有的研究表明，随着种植年限的增加，农林复合的可可园土壤有机碳（SOC）、P、Ca、Mg等养分含量显著提高，30龄可可园SOC储量可达到森林碳储量的85%[9]。目前，关于可可种植方面的研究偏重于拉丁美洲、非洲和亚洲的印度尼西亚等国家和地区[10]，由于气候、土壤和种植技术等因素限制，所得结论并不能简单地应用到我国可可园。另一方面，可可在我国仍是新兴热带经济作物，因地制宜地研究不同园龄可可根际土壤演变规律，不仅是关于我国可可生态系统研究的基础工作，而且对其它多年生热带经济作物生产具有现实的指导意义。

近年来，在多年生热带经济作物土壤质量方面的研究已有很多报道。赵青云等[11]对不同年限香草兰生理状况及根际土壤微生物区系研究表明，种植10 a以上的香草兰植株生长代谢缓慢，土壤微生物由细菌型向真菌型转变，微生物区系失衡。Li等[12]研究表明，长期连续单作使胡椒根际土壤微生物区系组成发生变化，从而抑制胡椒生长。Liu等[13]研究了不同林龄人工橘林土壤微生物活性特征，认为土壤pH值的降低影响土壤微生物区系、微生物活性、微生物生物量碳、氮和养分含量，进而影响土壤功能的正常发挥。目前，关于不同园龄可可根际土壤质量变化的研究还不足，缺乏优化田间管理技术的可靠依据。SOC含量是评价土壤质量的重要指标之一[14]，热带地区农业SOC的水平较低[15]，因此，热带农业系统中的SOC管理对生产可持续性具有重要意义。土壤酶是生态系统的生物催化剂，在土壤物质循环和能量转化过程中起着重要作用[16]，反映了土壤中各种生物化学过程的强度和方向，可以作为评价土壤肥力状况的指标，也是反映土壤质量的生物活性指标[17]。微生物是影响陆地土壤碳积累和损失的主要影响因素，通过促进细胞内和细胞外酶的作用使SOC分解[18]。土壤酶和土壤微生物共同推动土壤的代谢过程[19]，土壤微生物也受土壤有机质的影响[20]。确定土壤微生物群落的变化，有利于全面了解土壤微生物与SOC间的关系[21]。

本研究采用时空替代法比较研究园龄对可可苗生长及其根际土壤环境的影响，揭示不同園龄可可园土壤演变规律，以期为进一步对可可园SOC开展相关研究，探讨促进可可生长的有效途径提供基础数据，为促进可可生产的可持续发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2015年8月～2016年7月，在中国热带农业科学院香料饮料研究所温室进行（北纬18°45′，东经110°13′），该地位于海南省万宁市兴隆华侨农场。供试土壤取自中国热带农业科学院香料饮料研究所的不同园龄可可试验基地（0～20 cm），沙壤土，过10 mm筛，装入直径20 cm、高25 cm的育苗袋中，每袋装土4 kg，备用。

采集同一品种可可母树（热引4号）成熟果实的种子，经10% NaOH溶液表面消毒10 min，无菌水冲洗后播种在沙床，培育15 d后，选择长势一致的未完全张开子叶幼苗，移栽至育苗袋中。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 以不同园龄的可可园土壤为处理：低龄（4 a），中龄（12 a），老龄（32 a），以4 a可可园周边休耕地土壤为对照（CK），每处理20盆，共80盆。试验前测定各处理土壤养分含量（表1），试验期内不施肥，保持土壤湿度在60%左右。

1.2.2 测定指标及方法 （1）植株生理指标测定：收获前，在晴天08 ： 00～10 ： 00时进行，选取可可苗第4片完全展开叶，用Li-6400XT便携式光合作用测量系统（Li-COR，美国），设定系列光通量密度（photosynthetic photo flux density，PPFD）梯度：0、50、100、200、400、600、800 μmol CO2/（m2·s），用6400-02B LED红蓝光源叶室测定其净光合速率[Pn，μmol CO2/（m2·s）]，每个PPFD记录3个以上数据，每个处理4次重复，采用刘宇锋等[22]的方法拟合出最大光合速率（Amax）[μmol CO2/（m2·s）]。

（2）土壤酶活性测定：在生物量处理前采用抖土法收集新鲜根际土壤，采用四分法取适量土壤样品，分成2份，1份用于土壤可培养微生物数量测定，将样品装入冰盒中带回实验室，4 ℃冰箱内保存备用；1份风干后剔除根系等杂物，过0.425 mm筛，采用试剂盒法测定土壤多酚氧化酶（以每天1 g土壤中产生1 mg紫色没食子素表示，U/g）、脲酶（以每天1 g土壤中产生1 μg NH3-N表示，U/g）、酸性磷酸酶（以37 ℃中1 g土壤每天释放1 μmol酚表示，U/g）、蔗糖酶活性（以每天1 g土壤中产生1 mg还原糖表示，U/g），试剂盒购自苏州科铭生物技术有限公司，4次重复。

（3）土壤可培养微生物数量测定采用常规方法[23]。SOC含量采用TOC分析仪（Multi N/C 3100，Analytikjena，德国）HT1300 模块测定[24]。植株生物量测定用水充分浸湿根系附着土壤后，用自来水清洗，70 ℃烘至恒重，称量。

1.3 统计分析

采用SPSS 16.0（SPSS Inc.， 美国）进行统计分析，Microsoft Excel 2010绘图。

2 结果与分析

2.1 园龄对可可苗生长的影响

由图1可知，随着园龄增加，可可苗干重呈增加趋势。32 a园龄土壤培育可可苗干重显著高于其它处理，分别比4 a、12 a和CK增加了89.15%、29.24%和28.03%。12 a和4 a园龄土壤培育可可苗干重差异高于CK，分别增加了47.73%和46.36%。不同园龄可可土壤培育的可可Amax表明（图2），12 a的Amax[3.37 μmol CO2/（m2·s）]最高，4 a[3.25 μmol CO2/（m2·s）]>32 a[3.10 μmol CO2/（m2·s）]>CK[2.47 μmol CO2/（m2·s）]，各处理间差异不显著，相关性分析表明，生物量与Amax间的相关系数为0.45。

2.2 园龄对SOC含量的影响

由试验前SOC含量可见（表1），随着园龄增加，各处理SOC含量呈增加趋势。经过不同园龄土壤培育1 a后，各处理SOC 含量的变化趋势与Amax相似，可可根际SOC含量均显著高于CK（7.66 g/kg），以12 a（16.25 g/kg）园龄最高，分别比4 a（12.94 g/kg）和CK增加了25.60%和112.17%，32 a（15.46 g/kg）分别比4 a和CK增加了19.46%和101.80%（图3）。与试验前相比，除CK降低外，不同园龄处理SOC含量提高了8.49%～40.65%，且随着园龄增加，提高的比率呈降低趋势。相关性分析表明，SOC含量与Amax间的相关系数为0.83，可见，SOC含量与光合作用间具有较强的相关性。

2.3 园龄对土壤酶活性的影响

由表2可见，不同园龄土壤培育可可根际土壤多酚氧化酶和酸性磷酸酶活性均无显著差异。各处理多酚氧化酶活性均低于CK，4 a、12 a和32 a园龄分别比CK降低了18.34%、69.24%和51.99%。4 a和12 a 园龄土壤酸性磷酸酶活性分别比CK增加了23.65%和29.08%，32 a园龄最低（10.70 U/g）。12 a和32 a园龄土壤脲酶活性显著高于CK，分别比CK增加了44.36%和43.11%，4 a比CK增加了9.94%，但差异不显著（p>0.05），12 a和32 a园龄间土壤脲酶活性也不显著（p>0.05）。12 a园龄土壤蔗糖酶活性显著低于CK、4 a和32 a园龄，分别降低了74.15%、73.45%和68.47%，4 a蔗糖酶活性高于32 a，但差异不显著（p>0.05）。由此可见，随着园龄增加，可可根际土壤脲酶活性提高，多酚氧化酶和蔗糖酶活性先降低后升高。

2.4 园龄对根际土壤可培养微生物数量的影响

如图4-A所示，不同园龄土壤培育可可根际土壤细菌数量均低于CK，4 a高于12 a和32 a园龄，但各园龄根际土壤细菌数量差异不显著（p>0.05）。不同园龄土壤培育可可根际土壤放线菌数量均高于12 a（图4-B），但仅32 a与12 a间差异显著，增加了21.66%，32 a和4 a分别比CK 增加了18.44%和5.07%，32 a比4 a增加了2.72%，但差異均不显著（p>0.05）。12 a园龄土壤培育可可根际土壤真菌数量较高（图4-C），分别是4 a、32 a和CK的3.04、1.46和3.23倍，12 a和32 a间差异不显著（p>0.05），但显著高于4 a和CK。

2.5 不同园龄土壤相关性分析

表3数据分析表明，植株干重与根际土壤放线菌数量、脲酶活性、SOC含量显著正相关。真菌数量与细菌数量显著负相关，与多酚氧化酶活性、蔗糖酶活性极显著负相关，而与脲酶活性、SOC含量极显著正相关。脲酶活性与细菌数量极显著负相关，与多酚氧化酶活性显著负相关。蔗糖酶活性与真菌数量极显著负相关，与酸性磷酸酶活性显著负相关，与多酚氧化酶活性极显著正相关。SOC含量与细菌数量、多酚氧化酶活性极显著负相关，与真菌数量、脲酶活性显著正相关，与蔗糖酶活性显著负相关。

3 讨论

SOC是陆地生态系统碳库的最大组成部分，在全球CO2变化中发挥着重要的平衡作用[25]。本研究中，32 a和12 a园龄处理根际SOC含量显著高于4 a园龄，说明老龄园有利于SOC的积累。王义祥等[26]对不同种植年限柑橘果园SOC含量（0～20 cm土层）进行了研究，结果表明，随着种植年限增加，果园SOC含量提高了27.2%；Tang等[27]发现，中国亚热带幼龄森林有机碳积累主要体现在植物生物量的增加，而成熟森林有机碳主要积累于土壤中，这些研究结果均和本研究结果一致。本研究相关分析表明，不同园龄可可苗生物量与根际SOC含量极显著正相关，而SOC含量与Amax间具有较强的相关性，可能是由于土壤微生物将部分光合碳转化为SOC[28-29]。本研究中培育1 a后，CK处理根际SOC含量比试验前降低，可能由于光合速率较低，土壤微生物获得可转化的碳少，此外幼苗生长也会消耗养分，因此，笔者认为，可可根际SOC含量是光合作用、植株生长和土壤微生物共同作用的结果。与本研究结果相似的，王春燕等[30]对不同种植年限橡胶园SOC含量研究的结果表明，12 a比4 a和19 a胶园SOC含量高即是凋落物分解、树木生长消耗营养物质和施肥等综合作用的结果。

土壤酶活性是评价土壤肥力的重要指标之一[31]。本研究中随着园龄增加，脲酶活性增加，且与SOC含量极显著正相关。李勇[32]研究表明，脲酶活性与SOC呈极显著相关（p<0.01）或显著相关（p<0.05），这与本研究结果一致。本研究结果显示，12 a园龄土壤蔗糖酶活性显著低于32 a园龄，且与SOC含量显著负相关。有研究表明，土壤蔗糖酶与SOC含量间的关系因施肥种类及种植方式不同而异[33]，土壤有机质含量增加，蔗糖酶活性提高[34]，这与本研究结果相反，可能是由于蔗糖酶与SOC的转化相关，其活性大小可间接表征SOC的转化情况[34-35]，12 a园龄处理土壤转化的SOC含量少，也导致了植株生物量显著低于32 a处理。

土壤微生物是植物养分供给的驱动力[36]，其群落结构和组成受到土壤有机质等因素影响[20]。土壤微生物群落功能和多样性的改变也可影响土壤质量和生态系统过程[37]。Snoeck等[7]调查了位于喀麦隆的60个可可种植园土壤中丛枝菌根真菌的孢子密度，发现低龄土壤的孢子密度显著低于老龄可可园。本研究结果显示，12 a园龄土壤培育可可根际土壤中可培养细菌数量减少，真菌数量则显著增加，分别是4 a和CK的3.04和3.23倍，说明随着园龄增加，可能导致土壤微生物区系变化，这与赵青云等[11]的研究结果一致。本研究中，不同园龄土壤培育可可根际土壤中可培养真菌数量与脲酶活性、SOC含量极显著正相关，可能的原因是随着园龄增加，SOC含量的提高为真菌生长提供更多易利用的营养物质，促进了某些土壤微生物数量的增加[34]。土壤微生物细胞的增殖和裂解释放出脲酶，增加了土壤中脲酶活性[38]。

本试验探讨了不同园龄对可可根际土壤环境的影响，结果表明，32 a和12 a园龄处理根际SOC含量显著高于4 a园龄，老龄园有利于SOC的积累。不同园龄可可苗生物量與根际SOC含量极显著正相关。随着园龄增加，脲酶活性增加，且与SOC含量极显著正相关，土壤蔗糖酶活性与SOC含量显著负相关。12 a园龄土壤培育可可根际土壤中可培养细菌数量减少，真菌数量则显著增加，随着园龄增加，可能导致土壤微生物区系变化。可可根际SOC含量是光合作用、植株生长、土壤酶活性和土壤微生物共同作用的结果。可可园SOC是其土壤肥力和土壤质量的重要指标，了解可可园SOC的变化规律，以期为土壤管理和经营措施的制定提供科学依据，也为可可生态系统碳循环提供理论依据。近年来，高通量测序技术的快速发展为研究生态系统微生物区系及多样性提供了更有效的方法[39-40]。我国热区土壤微生物资源丰富，但土壤微生物群落特征如丰富度和多样性等仍有待深入研究，笔者拟采用 454高通量测序技术探索土壤微生物群落结构和多样性，以期进一步揭示可可园土壤演变规律，为促进可可生产的可持续发展提供理论依据。

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