新型均相电化学适配体传感器对黄曲霉毒素B1检测的研究

顾灿灿，郭大营

（浙江省碳材料温州大学化学与材料工程学院碳材料重点实验室，浙江 温州 325027）

新型均相电化学适配体传感器对黄曲霉毒素B1检测的研究

顾灿灿，郭大营

（浙江省碳材料温州大学化学与材料工程学院碳材料重点实验室，浙江 温州 325027）

本文提出了一种非标记均相电化学方法用于来检测黄曲霉毒素B1。该方法根据ITO电极表面长链DNA 和短链DNA 扩散性质的不同，与核酸外切酶的性质相结合，用于信号转换系统。当黄曲霉毒素B1存在时，其与核酸适配体反应释放的单链被外切酶切割扩散到电极表面，能观察到明显的电化学信号。该方法不仅能产生灵敏的电化学信号，而且还能实现对毒素的高选择性检测。

适配体传感器；生物毒素；均相反应

黄曲霉毒素主要产于黄曲霉及寄生曲霉，广泛存在于谷物类、花生制品、高粱及豆制品中[1]。其中，黄曲霉毒素B1 (AFB1) 是最常见的，且对人体及动物具有强效的致癌性，在许多试验中已被证实能够形成DNA加合物，引起肝细胞癌[2]。因此，发展有效的方法来检测AFB1，对早期癌症临床诊断和药物研究具有重大意义。虽然黄曲霉毒素B1活性的检测方法已经很成熟，但是大多数检测方法都存在操作复杂、耗时较长、检测过程中有放射性物质参与等问题。为了弥补这些方法的不足，发展了能够替代传统检测黄曲霉毒素B1活性的新分析检测技术，例如电化学分析技术、荧光分析技术、比色分析技术等[3-4]。近年来，电化学分析方法因其高效、快速、简便的操作而被广泛应用于分析检测中，一些文献[5-6]也报道了运用电化学方法测定毒素的方法，比如说直接通过电化学方法测定亚甲基蓝的氧化信号，或者把电化学和免疫法相结合，通过阻抗分析测定目标物活性的响应信号等，但这些方法的灵敏度都不太高。因此，发展非标记的、灵敏度高、选择性好的检测黄曲霉毒素B1活性的方法仍然是个很大的挑战。

为此，我们依据长链DNA和短链DNA在带负电荷的ITO电极上扩散性质的不同，提出了一种特异的非标记的均相溶液的方法，用于黄曲霉毒素B1的检测。在该方法中，识别部分是依据适配体能对毒素实现特异性识别，信号转换部分是依据在ITO电极上二茂铁标记的DNA链被酶切割后形成短链DNA，其扩散性变强使电信号增强。与其他检测黄曲霉毒素B1活性的方法相比[7]，这种非标记的均相电化学检测方法，因其无需复杂DNA链的设计和标记技术，似乎很容易实施。实验证明了这种非标记的方法应用于黄曲霉毒素B1的活性检测，具有较高的灵敏性和选择性。

1 实验部分

1.1 实验药品

无水乙醇（C2H5OH≥99.7%），核酸外切酶Ⅰ，核酸外切酶Ⅰ缓冲溶液，黄曲霉毒素B1，赭曲霉毒素A，MOPS（AR），氯化钠（AR）。

1.2 实验仪器

电化学工作站，超声波清洗仪，纯水-超纯水联用系统，电子天平，荧光光谱仪。

1.3 ITO电极的处理和双链的准备

首先准备双链DNA，即将探针1和探针2加入到300mM的MOPS缓冲溶液（内含有150mM的NaCl）中，在37℃下水浴处理90min后，慢慢冷却到室温，形成所需双链DNA。

ITO电极用于检测之前，需要进行预处理。先将ITO电极在去离子水中超声15min，再在异丙醇、丙酮溶液、超纯水中各超声15min，然后于室温下将其浸泡在1mM的NaOH 溶液中5h，最后用去离子水超声5min 后用N2吹干备用。

1.4 DNA分析及电化学检测

DNA双链杂交反应后，将不同浓度的黄曲霉毒素B1加入到含有0.2unit·μL-1的核酸外切酶Ⅰ缓冲溶液中，然后在37℃水浴中反应1h以使反应完全，随后对上述溶液进行电化学检测。

所有电化学测试都通过760E电化学工作站在室温下进行。采用三电极体系，ITO为工作电极，银-氯化银电极为参比电极，铂电极为对电极。通过DPV的方法，从-0.1～0.7V进行检测，电化学方法测定得到的结果，误差值均从3次重复实验中获得。

2 结果与讨论

2.1 ITO电极在均相溶液中用于检测黄曲霉毒素B1活性的基本原理

鉴于之前的研究中，ITO电极在一系列处理后可以使表面带负电荷[8]，而DNA因为含有磷酸基团而带负电荷，则短链DNA所含负电荷就少，而长链DNA所含负电荷相对较多，相比于长链DNA，短链DNA更容易扩散到同样带负电荷的ITO电极表面，因为它们之间的相对斥力更小，所以我们提出了一种以ITO电极为工作电极，在均相溶液中结合酶催化信号放大技术，建立一个低成本无标记的黄曲霉毒素B1活性的检测方法。实验中，DNA杂交长链和目标物反应均在均相溶液中进行，无需繁杂的标记过程，因此具有很高的反应效率。其具体分析检测过程如图1 所示。首先将二茂铁标记的探针1（probe1）和黄曲霉毒素适配体杂交形成双链DNA，设计好的探针1包含18个碱基和在5’末端标记的二茂铁，当没有加入黄曲霉毒素B1时，因为杂交后的双链DNA和ITO电极之间有很强的斥力作用，所以几乎检测不到电信号。当加入目标毒素时，适配体和AFB1之间很强的结合力会使探针1从双链DNA上解离出来，然后核酸外切酶Ⅰ就会把探针1催化水解成带有二茂铁标记的单核苷酸。因其相对于ITO电极的电荷斥力相对更小，单核苷酸更容易扩散到ITO 电极表面，因此可以检测到很明显的电化学信号。同时，适配体-AFB1结合物上的适配体也被外切酶切割使毒素释放，来触发更多的反应、催化和分解，这样单个毒素就能引起多次反应，使电信号得到增强。其原理见图1。

图1 无修饰均相电化学适配体传感器和酶催化反应信号放大技术相结合用于检测黄曲霉毒素B1活性的原理图

2.2 黄曲霉毒素B1活性检测实验的可行性

该方法的信号转换主要是依靠二茂铁标记的DNA片段扩散到电极表面，与ITO电极相互作用获得的。因此，我们首先初步研究了加入黄曲霉毒素B1前后的均相溶液反应后的电化学性能。如图2所示，没有加入目标毒素时，来自二茂铁的电化学信号几乎可以忽略不计，也就是说二茂铁产生的DPV信号很小，这是因为长链DNA带有过多的负电荷。但是，当加入黄曲霉毒素B1时，可以观察到一个很强的电流峰，这是因为经过酶切割单链反应，溶液中有很多二茂铁标记的单核苷酸能轻易地扩散到ITO电极表面。这个结果证明了实验的可行性。

图2 均相电化学适配体传感器和酶催化反应信号放大技术相结合用于检测黄曲霉毒素B1活性的DPV图

2.3 黄曲霉毒素B1活性检测实验条件的优化

本文进一步研究了影响本实验电化学响应信号的因素。在本实验中，DNA杂交效率是提高生物传感器灵敏度的关键因素。随着捕获DNA探针的浓度增加，将会产生高的背景干扰峰，而二茂铁标记DNA探针浓度过低会使电化学信号响应减弱，因此二茂铁标记探针浓度条件应首先优化。在实验中，AFB1、适配体链、核酸外切酶Ⅰ的浓度先分别设为1.0ng·mL-1、2.0μM、0.2unit·μL-1，然后将捕获探针DNA的浓度从0.2～2.0μM进行实验。可以看到，随着二茂铁标记探针DNA浓度增加，DPV所测的峰电流值先增加，直到二茂铁标记探针的浓度为1.0μM时，峰电流值开始减弱[图3（A）]。因此，二茂铁标记的DNA探针的浓度为1.0μM是构建生物传感器的最佳浓度。

DNA杂交时间是影响均相生物传感器性能的另一个重要因素，杂交时间过短同样会产生很高的背景干扰峰。这是因为时间过短会使溶液中有大量的未杂交的二茂铁标记DNA，能被外切酶催化分解产生强的电信号。随着杂交时间的增加，ΔI（加入毒素前后电流的差值）先增加，直到90min 后达到一个平台[图3（B）]。因此，90min为DNA杂交反应的最优时间。

图3 实验条件优化图

长时间的均相溶液反应将对 DNA 单链进行信号放大， 这也是影响适配体传感器分析性能的一个重要参数。目标物反应时间主要是与适配体-AFB1结合物的形成及外切酶催化分解单链有关。如图3（C）所示，DPV信号随着反应时间从20～60min持续增加然后变得稳定。因此，60min为最优的均相溶液反应时间。

此外，核酸外切酶Ⅰ在实验中起着举足轻重的作用，担任着信号放大和降低信号噪音的角色。因此，我们对核酸外切酶Ⅰ的浓度做了考察。从图3（D） 中可知，当反应体系中核酸外切酶Ⅰ的浓度为0时，因毒素和适配体的特异性结合使溶液中有大量游离的二茂铁标记DNA，没有酶催化反应发生，相应地产生的电化学信号就会相对较弱，峰电流信号为 -0.1μA左右。随着核酸外切酶Ⅰ浓度增加，峰电流响应信号逐渐增强，直到 0.2unit·μL-1时，峰电流到达一个平台，说明此时该体系中酶切反应已经基本完成。因此，选择 0.2unit·μL-1为核酸外切酶Ⅰ的浓度，进行后续的实验。

2.4 对黄曲霉毒素B1活性的测定分析

在最佳的条件下，对黄曲霉毒素B1的活性进行评估。图4是不同浓度的黄曲霉毒素B1对应不同的DPV响应信号。可以观测到随着黄曲霉毒素B1浓度从0 ng·mL-1到1.00ng·mL-1逐渐增加，电化学信号逐渐增强，说明当高浓度的黄曲霉毒素B1存在时，能与更多的适配体结合，使游离出的二茂铁标记DNA能被非常高效地降解，并通过DPV来对黄曲霉毒素B1进行定量分析。如图5所示，黄曲霉毒素B1与DPV响应信号之间存在良好的线性关系。线性相关系数R= 0.9928。该方法测得的黄曲霉毒素B1的最低检测限是0.001ng·mL-1，低于之前报道过的检测方法[9-10]。这个实验结果说明，本章提出的均相的非标记的电化学检测方法可以快速有效地用于黄曲霉毒素B1的定量分析。该方法的优势不仅归功于适配体对黄曲霉毒素B1的特异性识别，还归功于长链与短链DNA在ITO电极上扩散性的不同，并且外切酶对单链的切割产生了信号放大作用。

图5 AFB1浓度相对于峰电流的线性关系，图中的误差值是通过3次实验结果得到的

2.5 黄曲霉毒素B1活性的特异性考察

我们建立的黄曲霉毒素B1的活性分析方法不仅在检测方法上体现出高效性，而且在选择性实验中也表现出卓越的品质。以赭曲霉毒素a、赭曲霉毒素b、伏马毒素B1进行对比来评估该方法的选择性能力。如图6所示，其他干扰离子即使浓度高很多，仍然对传感器检测AFB1的影响甚微。由于适配体对黄曲霉毒素B1有特异性识别作用，不识别其他的毒素，所以本文论述的均相电化学适配体传感器有很强的选择性。

图6 不同的毒素的DPV响应信号

3 结论

本文在一种均相溶液中，无标记运用适配体，将黄曲霉毒素B1特异性和核酸内切酶的特点相结合，建立了一种非标记的黄曲霉毒素B1活性的检测方法。相对于其他检测方法，本文提出的均相溶液检测方法较容易操作，也不需要复杂DNA链的设计和电极标记技术，表现出了较高的重现性和选择性。实验结果证明，这一方法可快速灵敏地检测黄曲霉毒素B1的活性和含量，在临床诊断和药物研究方面具有巨大的应用潜力。

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Study on A Novel Homogeneous Biosensor for AFB1 Detection

GU Cancan，GUO Daying
(Institute of Chemical and Materials Engineering, Key Laboratory of Carbon Materials in Zhejiang Province, Wenzhou University, Wenzhou 325027, China)

A novel electrochemical aptasensor was designed for the detection of AFB1. This sensor realized electrochemical detection of AFB1 in a homogeneous solution, with sensing signals amplified by an exonuclease I-based tar get recycling strategy. In the presence of analyte AFB1, an increased electrochemical signal could be observed.

biosensor; mycotoxin; homogeneous reaction

O 657.1

A

1671-9905(2017)05-0038-05

2017-03-06