2株乳酸菌的生长和潜在益生菌特性

杨静，马如慧，杨智茜，徐爽，李铎，陈兰明*

（1.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估重点实验室/上海海洋大学食品科学与技术学院，上海201306；2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州310058）

2株乳酸菌的生长和潜在益生菌特性

杨静1，马如慧1，杨智茜1，徐爽1，李铎2，陈兰明1*

（1.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估重点实验室/上海海洋大学食品科学与技术学院，上海201306；2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州310058）

通过研究和比较2株乳酸菌——植物乳杆菌D28（Lactobacillus plantarumD28)和粪肠球菌B21（Enterococcus faeciumB21)的生长曲线，对NaCl和胆盐的耐受性，对人工胃液和人工肠液的耐受性，以及它们的体外抗氧化能力和胆盐水解酶活性，判断其是否具有益生菌特性，以期为后期菌株功能研究提供理论基础。生长曲线试验表明，L. plantarumD28的最大生长速度出现在18 h左右，而E.faeciumB21为16 h左右。起始pH对2株菌生长的影响很大，L.plantarumD28的最适生长pH为5.5～7.0，而E.faeciumB21为pH 6.0～7.0。耐受性试验表明：E.faeciumB21对NaCl和胆盐的耐受性较好，高于L.plantarumD28；L.plantarumD28在人工胃液（pH 2.0，180 min）和人工肠液（pH 8.0，240 min）中的菌群存活率均显著高于E.faeciumB21。采用DPPH（二苯基苦基苯肼）自由基清除率来测定2株菌的体外抗氧化活性，结果表明，2株菌均具有一定的抗氧化活性，且L.plantarumD28的抗氧化活性（34.86%）显著高于B21（25.32%）。采用茚三酮法测定菌株的胆盐水解酶活性发现，E.faeciumB21的胆盐水解酶活性（0.415 U/ mg）显著高于L.plantarumD28（0.114 U/mg）。综上表明，L.plantarumD28和E.faeciumB21均具有一定的益生特性，且这2个菌株均可应用于乳酸菌降低胆固醇活性的研究，且L.plantarumD28还可以用于应用乳酸菌提高体内抗氧化活性的进一步研究中。

乳酸菌；生长特性；抗氧化活性；胆盐水解酶活性

SummaryProbiotics are defined as“living micro-organisms which,upon ingestion in certain numbers,exert health benefits beyond inherent basic nutrition”.Recent reports have confirmed that probiotics can provide a variety of beneficial health effects, which are strain dependent.The regulation effect of probiotics was based on tolerance of acid environment in the stomach,and resistance to bile salt and trypsin in the small intestine.Most of lactic acid bacteria(LAB)are considered as probiotics,and have been widely used as dietary additives in cultured dairy foods and other fermentation products.The source of LAB may be naturally fermented food or human and animal intestines.

In this study,two strains were isolated from Chinese traditional food(Northeast pickle and stinky beans),and identified asLactobacillus plantarumD28 andEnterococcus faeciumB21 by 16S rRNA gene sequences,respectively.The growth and potential probiotic characteristics of the two lactic acid bacteria strains were further investigated.

Growth curve and the effect of initial pH on the growth were studied by spectrophotometry method.Meanwhile,the resistance characteristics were investigated,including sodium chloride(NaCl),bile salt,artificial gastric juice and artificial intestinal juice.In addition,antioxidant activity and bile salt hydrolase activity(BSH)in vitrowere determined by scavenging DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)free radical and ninhydrin method,respectively.

The results of growth curve showed that the growth rate ofL.plantarumD28 was faster thanE.faeciumB21 under the same culture condition,and the stationary growth phase ofL.plantarumD28 andE.faeciumB21 occurred at 18 h and 16 h, respectively.The growth rate of the two strains was affected by different initial pH;pH ranges of 5.5-7.0 and 6.0-7.0 were most favorite initial pH forL.plantarumD28 andE.faeciumB21,respectively.Moreover,L.plantarumD28 had a good tolerance against NaCl(5%)and bile salt(0.15%)in vitro,andE.faeciumB21 had a better tolerance against NaCl(8%)and bile salt (0.45%).Time-dependent behavior was found in the bacterial survival amount under the artificial gastric juice(pH 2.0)and artificial intestinal juice(pH 8.0)conditions.After treatment with artificial gastric juice(pH 2.0)for 180 min,the survival rate ofL.plantarumD28 was higher thanE.faeciumB21,remaining 41.33 lg(CFU/mL)and 8.33 lg(CFU/mL),respectively.Moreover, similar result was found with treatment of artificial intestinal juice(pH 8.0)for 240 min,36.33 lg(CFU/mL)and 18.67 lg(CFU/ mL)forL.plantarumD28 andE.faeciumB21,respectively.In addition,the two strains had certain antioxidant activityin vitro, andL.plantarumD28 had a higher DPPH free radical scavenging activity(34.86%)than that ofE.faeciumB21(25.32%). Besides,both of the two stains had bile salt hydrolase(BSH)activity,andE.faeciumB21(0.415 U/mg)had a higher BSH activity than that ofL.plantarumD28(0.114 U/mg).

In conclusion,the growth rate of the two strains is affected by different initial pH,andL.plantarumD28 has a higher growth rate thanE.faeciumB21.L.plantarumD28 andE.faeciumB21 both have tolerance to acid,bile salt,and NaCl,and are able to survive under the conditions of artificial gastric juice and artificial intestine juice.Therefore,bothL.plantarumD28 andE.faeciumB21 can be used as candidate for probiotic strains and application for lowering cholesterol research,andL.plantarumD28 can especially be applied to antioxidant-related research.

益生菌是指当摄入一定数量后，能以活菌状态到达胃肠道的单一或特定微生物的混合物。作为促进机体健康的有益菌[1]，益生菌具有增强人体免疫力、调节肠道健康、促进营养物质消化吸收、降低胆固醇、缓解肥胖、抑制癌细胞生长、减肥等功能[2-6]。为了发挥其在人体中的有益作用，益生菌必需可以耐受胃中的酸性环境，抵抗小肠中存在的胆盐和胰酶，从而顺利到达人体肠道，黏附并定殖在肠道内，进而发挥其益生作用[7-8]。目前，一些应用于益生菌产品的菌株由于较弱的耐酸、耐胆盐能力，从而影响了其在机体肠道内发挥益生作用[9]。

本实验室（农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估重点实验室）从传统发酵食品——东北泡菜和臭豆子中分离出优势菌株，并通过16s RNA测序鉴定，分别为植物乳杆菌D28（Lactobacillus plantarumD28）和粪肠球菌B21（EnterococcusfaeciumB21）。为了更好地开发和利用这2个菌株，我们对其生长特性、部分益生特性（耐酸、耐NaCl和耐胆盐特性，耐受人工胃液和人工肠液特性，体外抗氧化和胆盐水解酶活性）进行了初步探索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

植物乳杆菌D28（L.plantarumD28）分离自东北泡菜，粪肠球菌B21（E.faeciumB21）分离自臭豆子。在MRS（de Man-Rogosa-Sharpe）固体培养基上生长48 h的菌落形态如图1所示：L.plantarumD28菌落凸起，呈圆形，表面光滑，细密，呈黄色；E. faeciumB21菌落凸起，呈圆形，表面光滑，细密，色白。革兰氏染色结果均为阳性。

图1 植物乳杆菌D28和粪肠球菌B21在MRS培养基上的菌落形态Fig.1 Colony morphology ofL.plantarumD28 andE.faeciumB21 on MRS agar plate

1.1.2 试剂

MRS固体和液体培养基（北京陆桥技术有限公司）；胃蛋白酶（活性为1∶3 000）、胰酶（1∶250）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；牛胆盐和琼脂（国药集团化学试剂有限公司）；氯化钠和溴甲酚紫（上海生工生物工程股份有限公司）；DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯基苦基苯肼）（Sigma公司，美国）。

1.1.3 仪器与设备

多功能酶标仪（BioTek公司，美国）；TGL-16C型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；PL2002电子天平（Mettler-Toledo公司，瑞士）；PHX-DHS-X型隔水式电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；pHS-3C pH仪（上海雷磁仪器厂）；LDZX-30FA型立式压力蒸汽式灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；Bioruptor®UCD200超声波破碎仪（Diagenode公司，比利时）。

1.2 菌株培养

将待测试的乳酸菌菌株以1%的接种量接入MRS液体培养基中，置于37oC厌氧培养箱中培养至对数期，连续培养2代，得到新鲜培养物，备用。

1.3 生长曲线测定

将经过2次传代培养18 h至对数期的新鲜培养物按0.1%（体积分数）接种量接入MRS培养基中，每隔2 h取样测定D600nm值；3次重复。

1.4 起始pH值对生长的影响

将经过2次传代培养的新鲜乳酸菌培养物在6 000 r/min下离心10 min，收集菌体，用无菌磷酸盐缓冲溶液（phosphate-buffered saline，PBS）（pH 7.4）离心洗涤3次（避免带入接种物中的酸性物质改变pH），然后按照接种率1%（体积分数）接种到不同起始pH值的MRS液体培养基中，在37oC下静置培养18 h，测定培养物在600 nm波长处的吸光度值（D600nm），以判断起始pH值对生长的影响；3次重复。

1.5 耐受性测定

将经过2次传代培养至对数期的新鲜乳酸菌培养物在4 000 r/min下离心10 min，收集菌体，用无菌PBS（pH 7.4）离心洗涤3次后，用等量无菌PBS悬浮，备用。

1.5.1 对NaCl和胆盐的耐受性

按体积分数1%的接种量分别将菌株接入到含有不同浓度NaCl或胆盐的MRS液体培养基（添加溴甲酚紫）中，在37oC下静置培养18 h，观察培养物的产酸变色情况，从而判断测试菌株对NaCl和胆盐的耐受性；8次重复。

1.5.2 对人工胃液的耐受性

参照CHARTERIS等[9]的方法，将0.2 mL细胞悬液（1×108CFU/mL）接种于膜过滤除菌（0.22 μm）的1.0 mL人工胃液（pH 2.0）和0.3 mL NaCl中，充分混匀，并在37oC恒温水浴槽中处理，分别于人工胃液处理1、90和180 min后取样，梯度稀释，以标准平板法计数（稀释倍数为1×10－10）；3次重复。

1.5.3 对人工肠液的耐受性

参照CHARTERIS等[9]的方法，将0.2 mL细胞悬液（1×108CFU/mL）接种于膜过滤除菌（0.22 μm）的人工小肠液（pH 8.0）和0.3 mL NaCl中，充分混匀，并在37oC恒温水浴槽中处理，分别于人工小肠液处理1和240 min后取样，梯度稀释，以标准平板法计数（稀释倍数为1×10－10）；3次重复。

1.6 清除DPPH自由基的能力测定

参考LIN等[10]的方法，略微改动。将保存的乳酸菌菌株在MRS培养基中2次传代培养活化，然后按1%（体积分数）接种于MRS肉汤培养基中，在37oC下培养16～18 h，得到乳酸菌培养物；取1 mL细胞培养物于6 000 r/min、4oC下离心10 min，收集菌体细胞沉淀，并用PBS（pH 7.4）洗涤2次，并重新悬浮调整细胞终浓度为1×109CFU/mL（D600nm=1.1），即为乳酸菌的完整细胞（intact cells,IC）。将获得的完整细胞用超声波破碎仪破碎细胞（在功率300 W条件下，冰浴超声处理5 s，间隔5 s，持续时间10 min），然后以4oC、8 000 r/min离心10 min，弃沉淀得到的上清液即为乳酸菌的无细胞提取物（intracellular cell-free extracts,CFE）。

参照LIN等[11]的方法，略微改动。分别取800 μL样品与1 mL新配制的DPPH溶液（含0.2 mmol/L无水乙醇）于2 mL棕色离心管中混合均匀，置于室温下避光反应30 min，然后将反应物以6 000 r/min离心10 min，取上清液，测定样品在波长517 nm处的吸光度值（As），对照组以等体积蒸馏水代替样品，其吸光度值记为Ab。对DPPH自由基清除率的计算公式如下：DPPH清除率=(Ab-As)/Ab×100%。

1.7 胆盐水解酶活性测定

乳酸菌菌株无细胞提取物（CFE）的胆盐水解酶（bile salt hydrolase,BSH）活性可以通过测定胆盐酰胺键水解产生的氨基酸的量来确定[12-13]。参考LIONG等[12]的方法，稍做修改，用于测定菌体胞内BSH活性。步骤如下：将过夜培养的细胞离心分离（4oC，8 000 r/min，10 min），用0.1 mol/L PBS（pH 7.0）洗涤2次，然后再悬浮于PBS（pH 7.0）中，以调整菌体的D600nm为3～5；加入二硫苏糖醇10 mmol/L用以减少酶的氧化，随后用超声波破碎仪破碎细胞，功率调整到H位置，时间10 min，超声处理为5 s的开/关（on/ off）循环交替，将样品置于水冷却器内保持在4oC下超声处理，在4oC、8 000 r/min下离心10 min后，弃沉淀得到的上清液即为CFE，储存在－20oC冰箱中。取10 μL CFE样品，加入180 μL PBS（0.1 mol/L，pH 6.0）、10 μL牛磺酸胆盐（10 mmol/L）和10 μL液体石蜡，混匀后置于37oC孵育30 min，然后立即加入200 μL质量体积分数为15%的三氯乙酸终止反应（以反应后加入牛磺酸胆盐的样品作为对照组），混合均匀，离心10 min（离心机最大转速，4oC），得到上清液；取100 μL上清液（样品/对照）与1.9 mL茚三酮试剂［0.5 mL茚三酮按1%（质量体积分数）的比例溶解于pH 5.5的0.5 mol/L柠檬酸钠缓冲液中］充分混合，并与1.2 mL甘油和0.2 mL 0.5 mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 5.5）混合，振荡混匀，沸水浴14 min，然后在自来水中冷却3 min，测定在570 nm处的吸光度值。标准曲线用甘氨酸制备。BSH的酶活单位表示在单位时间内、单位质量总蛋白质中的粗酶使牛磺胆酸水解产生氨基酸的物质的量。蛋白质浓度用Bradford蛋白测定试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）测定，并用牛血清白蛋白制作标准曲线。

1.8 数据分析

采用SPSS 20.0统计软件对试验所得数据进行统计分析，结果用平均值±标准差表示，并用GraphPad Prism 5.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 菌株生长曲线测定结果

从图2可以看出：L.plantarumD28在培养最初的4 h内生长缓慢，培养6 h后进入对数生长期，培养18 h时D600nm达到最大，为1.591，随后进入稳定期；E.faeciumB21在培养最初的6 h内生长缓慢，培养8 h后进入对数生长期，在培养16 h时D600nm达到最大，为0.872，随后进入稳定期；同时，在相同培养条件下，L.plantarumD28的生长速度显著高于E. faeciumB21。

图2 植物乳杆菌D28和粪肠球菌B21在液体MRS培养基图2中的生长曲线Fig.2 Growth curve ofL.plantarumD28 andE.faeciumB21 in MRS Fig.2 medium

2.2 不同初始pH值对菌株生长情况的影响

分别将L.plantarumD28和E.faeciumB21接种到不同起始pH（2.0～7.0）的MRS液体培养基中，结果（图3）表明：L.plantarumD28的最适pH为5.5～7.0，E.faeciumB21的最适pH为6.0～7.0；菌株在低pH值环境下生长受到抑制，但仍有一定的存活量，且在pH 4.0～5.5时，L.plantarumD28的生长明显优于E.faeciumB21。

图3 不同起始pH值对植物乳杆菌D28和粪肠球菌B21生图3长的影响Fig.3 Effects of different initial pH on the growth ofL.plantarumD28 Fig.3 andE.faeciumB21

2.3 对NaCl耐受性测定结果

由表1可知：L.plantarumD28和E.faeciumB21在含0%～8.5%NaCl的MRS培养基中均可生长，但随着NaCl含量的升高，2株菌的生长逐渐受到抑制；2株菌均可以耐受5%及以下的NaCl，而菌株B21在6.5%～8%NaCl中的耐受性高于D28。

2.4 对胆盐耐受性测定结果

从表2可知：L.plantarumD28和E.faeciumB21在含牛胆盐0%～0.45%的MRS培养基中均可以生长；随着胆盐含量的升高，L.plantarumD28和E. faeciumB21的生长逐渐受到抑制，且菌株D28在高含量胆盐环境中的耐受性明显低于B21。

2.5 对人工胃液的耐受性测定结果

由表3可知：与对照相比，在人工胃液（pH 2.0）处理开始阶段，L.plantarumD28和E.faeciumB21的数量没有明显差别；当人工胃液处理90 min后，L.plantarumD28和E.faeciumB21的存活率降低，分别为176.00 lg(CFU/mL)和102.33 lg(CFU/mL)；而当处理180 min后，L.plantarumD28和E.faeciumB21的存活率锐减，但菌株D28的存活量高于B21，分别为41.33 lg(CFU/mL)和8.33 lg(CFU/mL)。

2.6 对人工肠液的耐受性测定结果

由表4可知：在人工肠液（pH 8.0）处理开始阶段，L.plantarumD28和E.faeciumB21的数量没有明显差别；当人工肠液处理240 min后，L.plantarumD28和E.faeciumB21的存活量降低，分别为36.33 lg(CFU/mL)和18.67 lg(CFU/mL)，且前者对人工肠液的耐受性高于后者。

表1 植物乳杆菌D28和粪肠球菌B21对不同质量分数NaCl的耐受性Table 1 Tolerance ofL.plantarumD28 andE.faeciumB21 against NaCl

表2 植物乳杆菌D28和粪肠球菌B21对不同质量分数胆盐的耐受性Table 2 Tolerance ofL.plantarumD28 andE.faeciumB21 against bile salt

表3 植物乳杆菌D28和粪肠球菌B21对人工胃液的耐受能力Table 3 Tolerance ofL.plantarumD28 andE.faeciumB21 against artificial gastric juice

表4 植物乳杆菌D28和粪肠球菌B21对人工肠液的耐受能力Table 4 Tolerance ofL.plantarumD28 andE.faeciumB21 against artificial gastric juice

2.7 对DPPH自由基清除能力测定结果

图4显示，2株试验菌完整细胞（IC）对DPPH自由基的清除能力均低于无细胞提取物（CFE），且L. plantarumD28（34.86%）无细胞提取物对DPPH自由基的清除能力显著高于E.faeciumB21（25.32%）（P＜0.01），但其无细胞提取物的DPPH自由基清除能力仍小于50%。

2.8 胆盐水解酶活性测定结果

图5表明，2株试验菌均具有较好的BSH活性，其中E.faeciumB21的BSH活性为0.415 U/mg，显著高于L.plantarumD28（0.114 U/mg）（P＜0.01）。

3 讨论

微生物生长曲线分为适应期、对数期、稳定期和衰亡期4个时期，在一般微生物试验中，通常采用微生物生长对数期中后期和稳定期的菌液。在本研究中，L.plantarumD28的生长速度高于E. faeciumB21，在MRS培养基中分别培养18 h和16 h后进入稳定期；培养基的起始pH对菌株的影响很大，在pH 4.0及以下环境下2株菌的生长受到抑制，但还是有一定的存活量。

胆盐是由肝细胞分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合而形成的钠盐或钾盐。目前，耐受胆盐被认为是筛选潜在益生菌菌株的基本标准[14]。前期研究表明，乳酸菌如果能够在胃肠道中存活和增殖，必须能够耐受5%左右的NaCl和0.3%的胆盐环境[15]。在本试验中，L.plantarumD28可以耐受6%的NaCl，而E. faeciumB21可以耐受8%的NaCl；但0.20%的胆盐即可抑制L.plantarumD28的生长，而E.faeciumB21可以耐受0.45%的胆盐。

图4 植物乳杆菌D28和粪肠球菌B21对DPPH自由基的清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging capacity ofL.plantarumD28 andE.Fig.4faeciumB21

图5 植物乳杆菌D28和粪肠球菌B21的胆盐水解酶活性Fig.5 Bile salt hydrolase activity ofL.plantarumD28 andE.faeciumFig.5 B21

人体只有摄入含有1×107CFU/g以上的乳酸杆菌对其身体健康才会有益[14]。但是人体内的胃和肠道环境都具有明显的抗菌特性，大多数菌株经消化道进入胃肠道以后是否能够抵抗人体内恶劣的胃和小肠环境，是乳酸菌在胃肠道中能否存活和正常发挥生理作用的先决条件[16]。在本试验中，L. plantarumD28和E.faeciumB21均具有一定的抗氧化活性，且前者显著高于后者。

DPPH法简单、快捷、灵敏并且重复性好，是评估菌株抗氧化能力最被广泛使用的方法。在本试验中，L.plantarumD28和E.faeciumB21均具有一定的抗氧化活性，且L.plantarumD28的活性显著高于E.faeciumB21。

研究表明，L.plantarum91的BSH活性为0.299 U/mg[17]，且乳酸菌的BSH活性与降低胆固醇水平成正比。在本试验中，E.faeciumB21表现出了显著的牛磺胆酸水解能力，能够产生BSH，具有较高的BSH酶比活力（0.415 U/mg），显著高于L.plantarumD28。

4 结论

从发酵食品中筛选出的2株菌（L.plantarumD28和E.faeciumB21）具有不同的生长特性，其生长速度受培养基起始pH值的影响，且在相同培养条件下，L.plantarumD28的生长速度快于E. faeciumB21；2株菌均具有NaCl和胆盐耐受性，以及对人工胃液和人工肠液的耐受性，两者均具有一定的益生菌特性；2株菌均具有较好的体外抗氧化活性和BSH活性，且L.plantarumD28可作为抗氧化菌株进行相关研究。此外，由于这2株菌均有较好的BSH活性，可以作为降低胆固醇的菌株进行相关研究。

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Growth of two lactic acid bacteria strains and their potential probiotic characteristics.

YANG Jing1,MA Ruhui1,YANG Zhixi1,XU Shuang1,LI Duo2,CHEN Lanming1*(1.Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation,Ministry of Agriculture/College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

lactic acid bacteria;growth characteristics;antioxidant activity;bile salt hydrolase activity

TS 201.3

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.05.191

Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.),2017,43(2):239-246

上海市科委项目（B-9500-10-0004）。

陈兰明（http://orcid.org/0000-0001-9537-8476），E-mail:lmchen@shou.edu.cn

（First author）：杨静（http://orcid.org/000-0001-8929-5391），E-mail:yangjing621@126.com

2016-05-19；接受日期(Accepted):2016-06-12