倪西源,黄吉祥,柳寒,潘兵,赵坚义*
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(1.浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所/植物有害生物防控国家重点实验室省部共建培育基地,杭州310021;2.浙江大学农业与生物技术学院作物科学研究所,杭州310058)
应用分子标记辅助选育甘蓝型油菜杂交种的可行性
倪西源1,黄吉祥1,柳寒1,潘兵2,赵坚义1*
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(1.浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所/植物有害生物防控国家重点实验室省部共建培育基地,杭州310021;2.浙江大学农业与生物技术学院作物科学研究所,杭州310058)
通过研究甘蓝型油菜不育系和恢复系间的遗传距离与杂种优势的相关性,探讨在应用油菜不育系选育杂交种过程中借助分子标记筛选理想恢复系的可行性。利用分布在甘蓝型油菜19条染色体上的66个分子标记对2个不育系(湘油15A和MSL72A)和26个品种(系)进行遗传多样性分析,进而分析遗传距离和杂种优势的相关性。结果发现,66个分子标记共获得254个多态性位点;聚类分析结果与品种(系)的区域特性相一致,26个材料被清晰地划分为4个类群:长江中下游地区,黄淮区,欧洲冬油菜和欧洲春油菜;杂交种双亲间遗传距离与超父本优势的相关性达到极显著水平,在湘油15A和MSL72A配制的F1杂种中,相关系数分别为0.647**和0.622**;此外,父本产量与杂种产量的相关性也达到极显著水平,相关系数分别为0.732**和0.615**。总之,与不育系具有较远的遗传距离、分属不同群组的恢复系容易配制出综合性状好、产量高的杂交组合;利用分子标记辅助筛选恢复系,可以提高选育获得强优势杂交组合的效率。
甘蓝型油菜;杂种优势;分子标记;遗传距离;杂种优势群
SummaryComparing to open-pollinated varieties,rapeseed hybrids had an obvious heterosis in seed yield and adaptation to environment.In the procedure of hybrid breeding,it is very important to select the male and female parents,which greatly affects the hybrid performance.For the traditional method of hybrid breeding,the selection of parent lines for combination is random, which lacks foreseeability of the hybrid performance.Application of marker-assisted selection(MAS)can enhance the efficiency and accuracy of the selection,and shorten the period of breeding program.Therefore,this study aims to introduce MAS into the procedure of hybrid breeding in rapeseed,and to enhance the efficiency of breeding elite hybrids with good performance.
In the present study,two male sterile lines and 26 cultivars(lines)were analyzed with 66 molecular markers.These makerswere distributed on 19 chromosomes ofBrassica napusand each chromosome contributed 2 to 4 markers.The two male sterile lines,MSL72A and Xiangyou 15A(XY15A),belong to a kind of genic male sterile(GMS)system named 9012A in rapeseed.The 26 cultivars(lines)included 19 semi-winter type cultivars(lines)from China,4 winter type and 3 spring type cultivars(lines) from Germany.Fifty-two hybrids were derived by crossing the two male sterile lines with the 26 cultivars(lines).A dendrogram was established based on UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic means)cluster analysis.Nei72 distance between two male sterile lines and 26 cultivars(lines)was calculated,and the correlation between genetic distance and heterosis of hybrid performance was analyzed.
The results showed that 254 polymorphic loci were derived from the 66 markers and each marker had a mean of 3.9 polymorphic loci.The mean genetic distance between XY15A and the 26 cultivars(lines)was 0.56,and the maximum and minimum genetic distances were 0.15 and 0.80,respectively.The mean genetic distance between MSL72A and the 26 cultivars (lines)was 0.58,and the maximum and minimum genetic distances were 0.28 and 0.84,respectively.The dendrogram and principal coordinate analysis of the two male sterile lines and the 26 cultivars(lines)showed that all the materials were divided into four primary groups,which were consistent with their geographical attribute.The four groups were the middle and lower reaches of Changjiang River,Huanghuai region,Europe spring type and Europe winter type.Correlation analysis indicated that the genetic distance based on molecular markers was significantly correlated with over male-parent heterosis of hybrid performance,and the correlation coefficients were 0.647**and 0.622**in hybrids derived from the two male sterile lines,XY15A and MSL72A,respectively.The seed yield of hybrids was also significantly correlated with the yield of male parents,and the correlation coefficients were 0.732**and 0.615**,respectively.
All the results indicate that the hybrid performance depends on the performance of parent lines and the genetic distance between the two parent lines together.It will be highly efficient in hybrid breeding by combining male sterile lines with elite restorers which should have good performance and enough genetic distance with male sterile lines.Therefore,we consider that molecular markers could be used to select restorers for male sterile lines in hybrid breeding of rapeseed and enhance the breeding efficiency.
国内外普遍认为,与常规油菜相比,杂交油菜对于提高品种产量、改善抗逆性和适应性方面具有明显优势。在杂交种选育中,科学地选择亲本配组是获得强优势组合的关键环节,因此,明确亲本间遗传差异与杂种优势间的关系,可以提高杂交种选育的效率。亲本间的遗传差异是杂种优势产生的前提,研究表明,亲本间的遗传距离与杂种优势具有很高的相关性[1-6],但也有研究认为,基于分子标记的遗传差异性分析还难以用来预测作物的杂种优势[7-9]。而借助分子标记技术构建具有一定遗传差异的杂种优势群,建立相应的杂种优势利用模式,可以更高效、准确地选配组合。温带玉米的杂种优势利用模式建立已有50多年,杂种优势群的建立是杂交玉米大获成功的关键之一[3],其理论基础和选育经验对油菜和其他作物的杂交种选育工作是很好的借鉴[10]。
油菜的杂种优势利用可通过雄性不育、自交不亲和以及化学杀雄等多条途径实现。其中,利用雄性不育系配制杂交种是应用最为广泛的一种方法。为了划分油菜不育系和父本品种(系)的遗传类群,明确不育系(母本)和恢复系(父本)间遗传距离与F1产量杂种优势的关系,从而在杂交种选育过程中指导亲本的选配,提高杂交种选育的预见性和效率,本研究选用均匀覆盖在甘蓝型油菜19条染色体上的66个分子标记,对2个油菜雄性不育系和26个油菜品种(系)进行遗传多样性检测,分析了亲本间遗传距离与杂种优势的关系,并探讨了在油菜杂交种选育中应用分子标记指导F1组合选配、构建杂种优势群的可行性,期望对油菜杂交种选育中亲本的选择提供参考依据。
1.1 研究材料
研究材料为2个甘蓝型油菜雄性不育系和26个油菜品种(系)(表1),以及2个不育系与26个油菜品种(系)按不完全双列杂交设计配制的52个杂交组合。不育系MSL72A是利用分子标记辅助技术,将德国NPZ-Lembke育种公司发明的MSL不育系统的相关育性基因通过连续回交导入浙江省主导品种“浙双72”中,从BC3F2世代获得两型系和临保系后杂交产生的全不育系。湘油15A(XY15A)是通过相同技术将9012A[11]不育系统中的2个不育相关基因导入湖南农业大学选育的双低油菜品种“湘油15”中,从BC3F2世代获得两型系和临保系后配制的全不育系。
表1 26个油菜品种(系)的类型、产地及其与2个不育系间的遗传距离Table 1 Types of 26 rapeseed cultivars(lines)from different origins and the genetic distances between these cultivars(lines)and two male sterile lines
表1 (续)Continuation of Table 1
1.2 分子标记
本研究选用定位于甘蓝型油菜SG遗传图谱上的标记[12],在每个连锁群上选取4~5个标记,共选用78个分子标记对28份DNA样品逐一进行分析,这些标记均匀分布在甘蓝型油菜的19个连锁群上。
1.3 田间测产试验
田间测产试验分3组进行:编号1~9的品种(系)和分别与2个不育系配制的18个杂交组合(共27个材料)为第1组;编号10~18的品种(系)和分别与2个不育系配制的18个杂交组合为第2组;其余8个品种(系)和分别与2个不育系配制的16个杂交组合为第3组。每个组内3次重复,重复内材料随机排列。各材料经苗床育苗后移栽,行距0.3 m,株距0.2 m,小区净长3.5 m、宽1.6 m(包含1侧排水沟宽度,约0.3 m)。多数试验小区成熟时统一收割,晾晒3~4 d后人工脱粒,然后装入尼龙网袋晾晒,称量。
1.4 DNA提取及标记分析方法
苗期取2个不育系及26个品种(系)的叶片。每份材料从5株幼苗上取等量叶片,混合装入离心管中。采用简易十六烷基三甲基溴化铵法提取基因组DNA,各单株DNA样品稀释成10 ng/μL后作为聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)模板。PCR反应体系按倪西源等[13]所述的进行。扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶[w(丙烯酰胺)∶w(甲叉双丙烯酰胺)=29∶1]电泳分离,银染法显色[14],显色完毕的凝胶用扫描仪扫描成电子图片保存。
1.5 数据采集和分析
待小区种子完全干燥,筛去茎秆、果壳等杂质后称量,小区产量为3个重复的平均数。每小区随机取种子20 g左右用于千粒质量测定和含油量分析。千粒质量用BS-124S型电子天平称量,精确到小数点后3位,每小区随机抽样称量2次,各500粒相加,重复间差异不超过0.02 g。含油量用近红外分析仪测定,取3次测定的平均值用于数据统计分析。
分子标记数据的统计以每条多态性带型作为一个多态性位点,有带赋值为1,无带赋值为0,数据缺失赋值为9。利用NTSYSpc 2.1软件计算遗传距离,并进行聚类分析和主成分分析;以Dice遗传相似系数(genetic similarity,GS)作为聚类的依据,采用Nei72遗传距离(genetic distance,GD)作相关性分析。Dice遗传相似系数的计算公式为GS=2Mij/(Mi+Mj),其中,Mij是亲本i和亲本j共有的位点数,Mi和Mj表示亲本i和亲本j包含的位点数;Nei72遗传距离的计算公式为GD=-ln GS[15]。聚类分析按非加权类平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)进行。采用SPSS 11.5软件分析遗传距离与杂种优势的相关性、父本产量与杂种产量的相关性。
1.6 杂种优势的度量
本文采用中亲优势、超亲优势和超父本优势,研究其与遗传距离的关系。在计算中亲优势、超亲优势时,分别以品种“湘油15”和“浙双72”的产量代表不育系湘油15A和MSL72A的产量。杂种优势的计算公式如下:中亲优势=(F1值-双亲平均值)/双亲平均值×100%,超亲优势=(F1值-高亲值)/高亲值×100%,超父本优势=(杂种产量-父本产量)/父本产量×100%[16-17]。
2.1 不育系和父本品种(系)的遗传多态性
本研究共用78个标记对2个不育系和26个品种进行标记分析,最终选取66个电泳结果清晰、数据完整的分子标记检测结果进行统计分析,共获得254个多态性位点(表2),平均每个标记含3.9个多态性位点。
表2 本研究所用分子标记及其所在染色体和多态性位点数Table 2 Chromosome position and polymorphic traits of the molecular markers used
不育系湘油15A与26个父本的平均遗传距离为0.56,与品种“湘油15”的遗传距离最小(0.15),与德国冬油菜品系RS1647的遗传距离最大(0.80),与其他24个父本间的遗传距离在0.38~0.76之间(表1)。不育系MSL72A与26个父本的平均遗传距离为0.58,与品种“浙双72”的遗传距离最小(0.28),与德国NPZ-Lembke公司提供的春油菜品系412205NPZ的遗传距离最大(0.84),与其他24个父本间的遗传距离在0.29~0.80之间(表1)。
2.2 不育系和父本的聚类分析及主成分分析
用66个分子标记的254个多态性位点数据,通过NTSYSpc 2.1软件进行聚类分析,获得2个不育系和26个品种(系)的聚类图(图1)。在相似系数0.56处分为2个大类:第1类包括所有长江中、下游共15个品种;第2类包括3个欧洲春油菜、4个欧洲冬油菜品种(系)和4个来自中国西安的育种材料。在相似系数0.64处第1类可细分为A、B、C、D 4组,MSL72A所在组和华双3号之间以及与其他3组之间均有较大的遗传差异,湘油15A与大多数长江中、下游的育成品种间遗传差异相对较小。第2大类也可进一步分为黄淮区、欧洲冬油菜和欧洲春油菜3个亚类。主成分分析结果与系统聚类树状图一致,较直观清晰地将26个品种和2个不育系聚成4类(图2),长江流域地区品种(A)与欧洲春油菜(D)的遗传距离最远,其次是欧洲冬油菜(C),与黄淮区油菜相对较近。
2.3 杂种优势分析
田间测产结果(表3)表明:26个父本的小区产量在635~1 500 g之间,平均为1 055 g,其中不育系湘油15A的背景品种“湘油15”是1 222 g,而不育系MSL72A的背景品种“浙双72”为1 500 g,在所有父本品种中产量最高;在分别与湘油15A(XY15A)和MSL72A配制的各26个杂交种中,其小区产量分别在1 046~1 682 g和1 090~1713 g之间,平均产量仅相差14 g。与MSL72A组合的千粒质量平均值(3.62 g)略高于湘油15A组合(3.49 g),其平均含油量也高于湘油15A组合0.6百分点。
图1 2个不育系和26个品种(系)的聚类图Fig.1 Dendrogram of the 2 male sterile lines and 26 cultivars(lines)
图2 2个不育系和26个品种(系)的主成分分析Fig.2 Principal coordinate analysis of the 2 male sterile lines and 26 cultivars(lines)
比较2个不育系各配制的26个杂交种,同时表现超亲优势的父本品种(系)是品6672、浙油50、中双11、组52、浙大622、浙油18和PRINCE。其中,来自陕西油菜杂交中心的组52和欧洲冬油菜PRINCE本身的产量水平并不高(898 g和756 g),但与湘油15A所配组合的中亲优势分别达到26.07%和35.67%、超亲优势达到9.37%和9.82%;在MSL72A组合中,中亲优势和超亲优势分别达到31.2%和40.1%、4.9%和5.3%:说明品种(系)组52和PRINCE的配合力较高。反之,浙双6号、浙油19、OASE、LOREUZ和412205NPZ 5个父本品种(系)的超亲优势均为负值,说明这5个父本材料的配合力不理想;在MSL72A组合中,超亲优势最强的3个组合(MSL72A×浙油50、MSL72A×中双11和MSL72A×浙油18)正好也是产量最高的3个组合,而在湘油15A组合中,超亲优势最强的3个组合的父本是沪油15、浙油21和中双7号,而产量最高的3个组合分别是用浙双72、沪油15和浙油50配制的杂种。综上所述,浙油50不但自身产量水平较高,而且一般配合力和特殊配合力都较好,可作为湘油15A和MSL72A这2个不育系的首选父本;另外,中双11和浙油18与MSL72A配组,沪油15和浙双72用作湘油15A的恢复系都是不错的选择。
2.4 遗传距离与杂种优势的关系
双亲间遗传距离和杂种优势的相关性检测结果(表4)表明:不育系湘油15A配制的26个杂交种双亲之间的遗传距离与中亲优势和超父本优势分别呈显著和极显著的正相关,相关系数分别为0.419和0.647;而与超亲优势呈负相关,相关系数为-0.209,但未达到显著水平。不育系MSL72A配制的杂交种亲本间的遗传距离与超父本优势呈极显著正相关,相关系数为0.622;与中亲优势和超亲优势分别呈正相关和负相关,但均未达到显著水平,相关系数分别为0.237和-0.346。
对父本产量及其杂种产量间的相关性分析表明,父本产量与湘油15A和MSL72A杂种产量的相关性均达到极显著水平,相关系数分别为0.732(P= 0.000)和0.615(P=0.001)。
表4 遗传距离与杂种优势的相关性检测Table 4 Correlation analysis between genetic distance and heterosis of seed yield
在甘蓝型油菜亲本间遗传距离与产量杂种优势的相关性研究中,前人的研究主要对油菜亲本间遗传距离与杂种产量的中亲优势或超亲优势的相关性做了分析。有研究发现,亲本间基于分子标记的遗传距离与杂种产量的中亲优势或超亲优势存在显著的相关性,可以用于指导杂交种的配组[4-5];同时,也有研究认为,分子标记可以用于油菜杂种优势的预测[7-9]。本研究发现,亲本间的遗传距离与杂种产量的超父本优势具有极显著的正相关性,同时,父本产量与杂种产量间也存在极显著的正相关。这表明在利用油菜不育系配制杂交组合时,应选用与不育系遗传距离较远且产量较高的品系作为父本。
虽然半冬性油菜与春油菜和冬油菜间存在较大的遗传差异,但由于生育期差异较大的原因,造成以半冬性油菜不育系与春油菜或冬油菜恢复系配制的杂交组合产量明显低于半冬性油菜不育系与半冬油菜恢复系配制的杂交组合产量。因此,春油菜和冬油菜品种不能直接用于选育强优势杂交组合,但可以通过与半冬性油菜杂交来选育新的品系,从而提高现有育种群体内品系间的遗传差异。
借助分子标记手段筛选与原有品种资源遗传距离较大并且适宜本地环境生产的新群体,然后用于杂交组合的选育,有利于育种成功。在适宜长江下游区域的油菜品种群体中,导入冬油菜、春油菜或国内其他区域油菜的遗传背景,通过田间适应性选择和分子标记筛选,构建1个或多个与原有群体具有较大遗传差异的新群体,然后在不同群体间选择亲本配制组合,最终选择适宜本地生态环境条件的杂种优势利用模式,在理论上是可行的。
在利用油菜不育系选育杂交种的过程中,首先利用分子标记估算不育系与恢复系间的遗传距离,然后选择与不育系具有较大遗传距离的优良恢复系来配制杂交组合,可以提高选育获得强优势杂交组合的效率。此外,在现有育种群体中通过杂交引入不同生态类型的遗传背景,然后在后代中借助分子标记辅助筛选来逐步扩大育种群体品系间的遗传差异,最终可以构建适宜的杂种优势群和杂种优势利用模式。
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Application of molecular marker in hybrid breeding of rapeseed(Brassica napus L.):A feasibility study.
NI Xiyuan1,HUANG Jixiang1,LIU Han1,PAN Bing2,ZHAO Jianyi1*(1.State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control/Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China;2.Institute of Crop Science,College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University, Hangzhou 310058,China)
Brassica napus;heterosis;molecular marker;genetic distance;heterotic group
S 334.5
A
10.3785/j.issn.1008-9209.2016.05.061
Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.),2017,43(2):173-182
国家重点研发计划项目(2016YFD0101300);浙江省农业新品种选育重大科技专项(2016C02050-8);浙江省植物有害生物防控重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地项目(2010DS700124-KF1506,2015-cxzt-05)。
赵坚义(http://orcid.org/0000-0002-6050-7335),E-mail:2208086097@qq.com
(First author):倪西源(http://orcid.org/0000-0002-2633-5234),E-mail:nixiyuan@yeah.net
2016-05-06;接受日期(Accepted):2016-07-27