PXD101 诱导人前列腺癌细胞PC3凋亡的线粒体信号通路*

胡明珠， 李 磊， 曹 蕾， 张一梅， 罗海华， 胡水旺， 刘爱华， 姜 勇△

(1 南方医科大学病理生理学教研室， 广东省蛋白质组学重点实验室， 2南方医院呼吸科， 广东 广州 510515)

PXD101 诱导人前列腺癌细胞PC3凋亡的线粒体信号通路*

胡明珠1， 李 磊1， 曹 蕾1， 张一梅1， 罗海华1， 胡水旺1， 刘爱华2， 姜 勇1△

(1南方医科大学病理生理学教研室， 广东省蛋白质组学重点实验室，2南方医院呼吸科， 广东 广州 510515)

目的： 探讨PXD101(又称belinostat)诱导人前列腺癌PC3细胞凋亡的线粒体通路。方法: PXD101以不同刺激时间和剂量处理PC3细胞，CCK-8法检测细胞的活力；流式细胞术检测细胞的凋亡率和线粒体膜电位；Western blot检测线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2、细胞色素C(Cyt C)和Bax； caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性。结果: PXD101能以时间和剂量依赖的方式抑制PC3细胞的存活(P<0.05)，流式细胞术检测结果表明PXD101处理后PC3细胞的凋亡率明显增加(P<0.01)。PXD101能时间依赖性致线粒体膜电位降低和Bcl-2 蛋白含量明显下降，Bax蛋白含量上升，促进线粒体释放Cyt C 蛋白，caspase-3活性明显增强。结论: PXD101通过线粒体途径诱导人前列腺癌细胞系PC3细胞凋亡。

前列腺癌； PXD101； 细胞凋亡； 线粒体； PC3细胞

前列腺癌在欧洲等国家居男性恶性肿瘤发病率的首位，致死率一直位居前3名，而在中国，近几年前列腺癌发病率也呈上升趋势[1-3]。

癌细胞凋亡在抑制前列腺癌疾病进展过程中起着关键性作用[4-5]。PXD101(又称belinostat)是一种有效的异羟肟酸类组蛋白脱乙酰酶(histome deacetylase， HDAC)抑制剂，在体外是有细胞毒性的，这种毒性增强了化疗作用[6-7]，且可以延迟卵巢癌和结肠癌中肿瘤的生长[8-9]。然而，PXD101在前列腺癌进展过程中的作用及其机制研究甚少，弄清PXD101诱导前列腺癌细胞凋亡的机制是突破点。现以PC3细胞为模型，探究PXD101诱导前列腺癌细胞凋亡的线粒体信号通路，为临床治疗前列腺癌提供参考。

材 料 和 方 法

1 细胞培养

人前列腺癌细胞系PC3由本实验室保存，采用含10%胎牛血清的1640培养液，于37 ℃、5% CO2条件下培养，待细胞生长至80%～90%融合度时进行传代。

2 主要试剂

PXD101(Denmark)；RPMI-1640培养液和血清(Gibco)；CCK-8活力检测试剂盒(南京恩晶生物科技有限公司)；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡双染试剂盒(凯基公司)；JC-1染液(Molecular Probes)；抗Bcl-2和Bax抗体(Cell Signaling Technology)；caspase-3活性检测试剂盒(Sigma)；兔抗caspase-3抗体(Sigma)；抗β-actin mouse mAb(HRP Conjugate)及HPR标记的抗鼠IgG购自CST； HPR标记的羊抗兔IgG购自Proteintech；其它试剂均为进口分装或国产分析纯。

3 主要方法

3.1 CCK-8法检测细胞活力 将PC3细胞以每孔5 000个接种于96孔板中，每孔100 μL培养基，于37 ℃、5%CO2条件下培养48 h后，向培养板中加入100 μL培养基，给予不同浓度PXD101(0、1、10和100 μmol/L)刺激48 h或10 μmol/L PXD101刺激不同时间(0、12、24和48 h)，空白组为不含细胞的培养基，每组设3个复孔。37 ℃、5% CO2条件下培养到达相应时点后，除去原有培养基，并用新的培养基洗涤细胞2次，然后加入新的培养基和10 μL CCK-8，培养箱中继续培养2 h，酶标仪下测定450 nm波长处的吸光度(A)。

3.2 流式细胞术检测PC3细胞凋亡 PC3细胞以每孔1×105个接种于6孔板，37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后更换培养基，给予10 μmol/L的PXD101刺激不同时间(0、24和28 h)。收集细胞及上清，根据试剂盒操作说明进行流式细胞定量分析。

3.3 线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential， MMP)的测定 取对数生长期的PC3细胞，以每孔1×105接种于6孔板内。37 ℃、5% CO2条件下培养48 h后更换培养基，给予10 μmol/L的PXD101刺激不同时间(0、24、28 h)。以终浓度为5 μmol/L JC-1，充分混匀后37 ℃孵育15 min，DPBS清洗去除残余的JC-1后，流式细胞仪测定样本。其中激发波长488 nm，应用侧向散射光(SSC)和前向散射光(FSC)圈定要分析的细胞后，每个样本获取10 000个细胞。应用流式细胞仪软件分析数据。

3.4 Western blot检测蛋白表达 取对数生长期PC3细胞， 以每孔2×105接种于6孔板中。37 ℃、5% CO2条件下培养48 h后更换培养基，给予10 μmol/L的PXD101刺激不同时间(0、12、24和48 h), 收集各组细胞，用DPBS 洗2次，加入150 μL RIPA裂解液，置于冰上30 min。13 000×g离心10～15 min， 取上清，BCA蛋白定量后，加5×上样缓冲液，98 ℃变性5 min，采用12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，之后电转移至PVDF 膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h，加入I 抗4 ℃孵育过夜。用TBST漂洗膜3次后，加入辣根过氧化酶标记的 II抗，室温孵育1 h。用TBST 漂洗3次，经SuperSignal West Pico化学发光底物显色，利用Kodak IS4 000R图像工作站进行化学发光检测。图片扫描后使用Gelpro软件测量蛋白条带的灰度值。

3.5 Caspase-3蛋白活性的检测 取对数生长期PC3细胞， 以每孔2×105接种于6孔板中。37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后更换培养基，给予10 μmol/L的PXD101刺激不同时间(0、8、12和24 h), 收集各组细胞，按照caspase-3活性检测试剂盒说明书进行操作。以488 nm激发光，525 nm发射光的M5酶标仪进行检测。

4 统计学处理

用SPSS 13.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较行SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PXD101对细胞活力的影响

CCK-8法检测结果显示，PXD101能够引起PC3细胞的活力下降，抑制细胞的生长，并且呈现剂量和时间依赖性，10 μmol/L PXD101刺激24 h能够引起PC3细胞的活力下降36.3%(P<0.01)，见图1。

2 PXD101诱导PC3细胞凋亡

流式细胞术结果表明，PXD101刺激24 h组的凋亡率为18.01%±2.37%，刺激48 h组的凋亡率为48.27%±5.10%，与对照组(3.85%±1.22%)相比，差异有统计学显著性(P<0.01)，见图2。

3 PXD101引起PC3细胞线粒体膜电位的变化

本研究中采用荧光探针JC-1的单体JC-1/聚合率比率这一指标反映线粒体膜电位。结果表明PXD101刺激后，单体JC-1/聚合率比例有所增加，PXD101刺激24 h组比例增加至对照组的(5.65±0.41)倍，刺激48 h组比例增加至对照组的(30.14±2.00)倍，差异有统计学显著性(P<0.01)，见图3。

Figure 1.The effect of PXD101 on PC3 cell viability detected by CCK-8 assay. A: the viability of the PC3 cells treated with PXD101 at different doses; B: the dynamic change of PC3 cell viability induced by 10 μmol/L PXD101 treatment for different time. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group；##P<0.01vs0 h group.

图1 PXD101对PC3细胞活性的影响

Figure 2.The effect of PXD101 on the apoptotic rate of PC3 cells detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.##P<0.01vs0 h group.

图2 PXD101对PC3细胞凋亡的影响

Figure 3.The effect of PXD101 on the mitochondrial membrane potential of PC3 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vs0 h group.

图3 PXD101对PC3细胞线粒体膜电位的影响

4 PXD101通过线粒体通路介导PC3细胞发生凋亡

为更进一步研究PXD101诱导PC3细胞发生凋亡的分子机制，采用Western blot对线粒体介导的凋亡通路所涉及的一系列信号分子进行检测，并提取了PC3细胞的胞质和线粒体蛋白测定细胞色素C(cytochrome C， Cyt C)的表达，结果表明，PXD101刺激后，随着时间的延长，Bcl-2 蛋白含量明显下降，Bax蛋白含量上升，线粒体Cyt C 蛋白从线粒体释放入胞浆，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4。

Figure 4.The expression of mitochondrial apoptosis pathway-related proteins Bcl-2, Bax, cytoplasmic cytochrome C (cyto-Cyt C) and mitochondrial cytochrome C (mito-Cyt C) determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h group.

图4 PXD101对PC3细胞线粒体通路相关蛋白表达的影响

5 PXD101引起PC3细胞caspase-3活性改变

Caspase-3活性检测表明，PXD101刺激PC3细胞后，随着时间的延长，caspase-3活性逐渐增强，刺激24 h时检测A值增加至0 h的(6.66±0.94)倍，差异有统计学显著性(P<0.01)，见图5。

Figure 5.Effects of treatment with PXD101 for different time on the changes of caspase-3 activity in the PC3 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vs0 h group.

图5 PXD101对PC3细胞caspase-3酶活性的影响

讨 论

前列腺癌是常见的非皮肤癌，近几年随着研究的深入与技术的发展，越来越多的研究表明表观遗传学的改变在癌细胞中起着重要作用[10]，所以通过乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化或三磷酸腺苷核糖基化来修饰组蛋白是一个重要的治疗途径，而在这些修饰中，组蛋白N末端尾部赖氨酸残基的乙酰化能够显著降低组蛋白对DNA的亲和力，导致与肿瘤抑制和(或)分化相关基因的表达[11]。这就提示我们HDAC抑制剂对于治疗癌症具有非常重要的意义和前景。有研究表明，HDAC在前列腺癌中的活性升高，这也促进了HDAC抑制剂作为抗肿瘤药物的研发[12-13]，但是目前用于临床的HDAC抑制剂只有辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)，而且仅用于皮肤T细胞淋巴瘤。而近几年关于新型羟肟酸类 HDAC 抑制剂PXD101研究越来越多，而对于它促进癌细胞凋亡的机制尚不完善。为了探讨PXD101对前列腺癌细胞凋亡的影响，本课题选取人前列腺癌细胞系PC3，采用CCK-8法检测了不同浓度及不同处理时间下，PXD101对PC3细胞活性的影响，结果表明，PXD101能够明显降低PC3细胞活性，并且呈现剂量与时间依赖性。进一步研究PXD101所导致的PC3细胞活性下降是否与细胞凋亡相关，流式细胞技术分析结果显示，PXD101能够显著地引起PC3细胞发生凋亡。

研究表明，PXD101促进癌细胞凋亡与Bcl-2蛋白家族有关[14-15]，而Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡的线粒体途径中起着重要作用，因此我们进一步研究PXD101促进前列腺癌细胞凋亡是否是通过线粒体途径。流式细胞术结果表明，PXD101呈时间依赖性地致MMP降低，Western blot检测发现Bcl-2 蛋白含量明显下降，Bax蛋白含量上升，线粒体Cyt C从线粒体释放到胞浆。Caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3 活性增强。这提示PXD101诱导PC3细胞凋亡是通过线粒体凋亡通路的。

综上所述，PXD101通过线粒体途径诱导人前列腺癌细胞系PC3细胞凋亡，从而阻止前列腺癌的发生发展。本研究针对临床治疗前列腺癌提供了新的思路。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

PXD101 induces apoptosis of human prostate cancer cell line PC3 by mitochondrial signal pathway

HU Ming-zhu1, LI Lei1, CAO Lei1, ZHANG Yi-mei1, LUO Hai-hua1, HU Shui-wang1, LIU Ai-hua2, JIANG Yong1

(1DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofProteomicsofGuangdongProvince,SouthernMedicalUniversity,2DepartmentofRespiratoryDisease,NanfangHospital,Guangzhou510515,China.E-mail:jiang48231@163.com)

AIM: To explore the mitochondrial pathway in the apoptosis of PC3 cells induced by PXD101 (also named as belinostat). METHODS: PC3 cells were treated with PXD101 at different doses or stimulated with PXD101 for different time. The effect of PXD101 on the viability of PC3 cells was measured by CCK-8 assay. The apoptotic rates and the mitochondrial membrane potential (MMP) were analyzed by flow cytometry. The protein levels of Bcl-2, Bax and cytochrome C (Cyt C) were determined by Western blot. The caspase-3 activity were tested by caspase-3 activity assay kit.RESULTS: The viability of the PC3 cells was inhibited by PXD101 in a dose- and time-dependent manner. Flow cytometric analysis showed that the apoptotic rates were increased in the cells treated with PXD101 (P<0.01). At the same time, PXD101 induced the decreases in MMP and Bcl-2, the release of Cyt C, and the increase in caspase-3 activity. CONCLUSION: PXD101 induces the apoptosis of human prostate cancer cell line PC3 by mitochondrial signal pathway.

Prostate cancer; PXD101; Apoptosis; Mitochondria; PC3 cells

1000- 4718(2017)05- 0793- 05

2017- 01- 05

2017- 03- 15

国家自然科学基金资助项目(No. 81372030)； 南方医科大学南方医院院长基金(No. 2015Z005)

R363.21； R730.23； R737.25

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2017.05.005

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 020-61648231； E-mail: jiang48231@163.com