米非司酮治疗大鼠子宫内膜异位症发病的TGFβ—Smad机制研究

陈旭伟　郭锦芳　厉华卿

[摘要] 目的 分析大鼠子宫内膜异位症发病的TGFβ-Smad信号通路参与机制及米非司酮的改善作用。 方法 将雌性SD大鼠随机分为假手术组、子宫内膜异位症模型组、小剂量和大剂量米非司酮组（n=10）。采用免疫印迹法检测各组大鼠异位组织中TGFβ-Smad信号通路的关键蛋白及细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达。结果 子宫内膜异位症模型组大鼠的TGFβ-Smad信号通路关键蛋白TGFβ、Smad1、Smad2及Smad3的表达均明显增高（P<0.01）；促细胞凋亡蛋白Bax及Caspase-3表达增强而Bcl-2表达降低（P<0.01）；米非司酮组大鼠的上述蛋白的异常得到显著恢复（P<0.01或P<0.05），且大剂量组效果明显优于小剂量组（P<0.05）。 结论 米非司酮可通过抑制激活的TGFβ-Smad通路改善大鼠子宫内膜异位症的异常。

[关键词] 子宫内膜异位症；TGFβ-Smad信号通路；米非司酮；细胞凋亡

[中图分类号] R711.71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）09-0039-04

Study on the effect of mifepristone on the TGFβ-Smad mechanism of the pathogenesis of endometriosis in rats

CHEN Xuwei GUO Jinfang LI Huaqing

Department of Gynecology， Dongyang Peoples Hospital in Zhejiang Province， Dongyang 322100， China

[Abstract] Objective To analyze the mechanism of TGFβ-Smad signaling pathway in the pathogenesis of endometriosis in rats and the improvement of mifepristone. Methods Female SD rats were randomly divided into sham operation group， endometriosis model group and mifepristone low dose group and high dose group（n=10）. The expression of key proteins in the TGFβ-Smad signaling pathway and the expression of apoptosis proteins such as Bax， Bcl-2 and Caspase-3 in ectopic tissues of rats were detected by immunoblotting method. Results The expression of key proteins in the TGFβ-Smad signalling pathway such as TGFβ， Smad1， Smad2 and Smad3 were significantly increased in the rats in the endometriosis model group（P<0.01）； the expression of apoptosis proteins such as Bax and Caspase-3 was increased and the expression of Bcl-2 was decreased（P<0.01）； the abnormalities of the above proteins in the mifepristone group were significantly recovered（P<0.01 or P<0.05）， and the effect in the high dose group was significantly better than that in the low dose group（P<0.05）. Conclusion Mifepristone can improve the abnormalities of endometriosis in rats by inhibiting the activated TGFβ-Smad pathway.

[Key words] Endometriosis； TGFβ-Smad signaling pathway； Mifepristone； Apoptosis

子宮内膜异位症是临床上常见的妇科疾病，主要表征为内膜细胞在不正常的位置生长[1，2]。子宫内膜异位症与多种因素相关，如遗传因素、环境因素及机体的免疫功能等[3，4]。但是目前关于子宫内膜异位症确切发病机制尚不明确。TGFβ-Smad信号通路是细胞内最常见的信号通路之一，参与了多种妇科疾病的发生及发展过程[5，6]。本研究旨在分析米非司酮对大鼠子宫内膜异位症发病的TGFβ-Smad信号通路的影响，为子宫内膜异位症的诊治提供参考，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

雌性清洁SD大鼠（上海斯莱克实验动物中心提供），许可证号SYXK（沪）2008-0047，体重110～130 g。所有动物均性成熟但未交配。所有实验动物在实验前适应性培养1周。将雌性SD大鼠随机分为假手术组（不进行子宫内膜异位症造模）、子宫内膜异位症模型组（进行子宫内膜异位症造模，不采用药物治疗）、小剂量和大剂量米非司酮组（n=10）。

1.2 方法

子宫内膜异位症造模：大鼠麻醉、固定，清洁消毒开腹处皮肤，开腹分离结扎大鼠左侧子宫，纵向剪开宫腔，剥离子宫内膜，宫体与右侧腹膜壁层缝合，关腹，继续饲养。

进行子宫内膜异位症造模后1周开始，喂给小鼠口服米非司酮（上海新华联制药有限公司生产，国药准字H10950202），小剂量组每日给予1次，每次10 mg/kg，大剂量组每日给予1次，每次100 mg/kg，连服3 d。

1.3 免疫印迹法检测相关蛋白的表达

取出大鼠的右侧腹膜壁层组织，通过组织形态学观察确认为子宫内膜异位组织生长，即为造模成功，将造模成功的子宫内膜组织充分匀浆后，加入等量蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳及半干法转膜至硝酸纤维素膜。转膜后将硝酸纤维素膜用脱脂牛奶封闭，然后与第一抗体（1∶500）温孵4 h，无菌PBS漂洗3次后与HRP标记二抗（1∶200）室温反应1 h漂洗后显色，用凝胶成像分析系统测定光密度，进行蛋白表达的定量分析。

1.4 统计学分析

采用SPSS20.0统计学软件，计量资料行t检验，计数资料行χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1模型组大鼠TGFβ蛋白的异常表达及米非司酮的干预作用

模型组大鼠子宫内膜组织TGFβ较假手术组高（P<0.01），小剂量和大剂量的米非司酮组大鼠的上述蛋白异常得到明显改善，且与模型组相比差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），见表1、图1。

2.2模型组大鼠Smad1/2/3蛋白的异常表达及米非司酮的干预作用

模型组大鼠子宫内膜组织Smad1、Smad2和Smad3蛋白较假手术组高（P<0.01），小剂量和大剂量的米非司酮组大鼠的上述蛋白异常得到明显改善，且与模型组相比差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），见表1、图2。

2.3模型组大鼠细胞凋亡蛋白的异常表达及米非司酮的干预作用

模型组大鼠子宫内膜组织Bax和Caspase-3蛋白的表达明显高于假手术组，而Bcl-2表达明显低于假手术组，且差异有显著统计学意义（P<0.01）；小剂量和大剂量的米非司酮组大鼠的上述蛋白异常得到明显改善，且与模型组相比差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），见表1、图3。

3讨论

子宫内膜异位症是临床上常见的妇科疾病，严重影响患者的身体健康和生活质量[7]。子宫内膜异位症患者临床上多表现为痛经、不孕、月经异常及性交疼痛等，也可能出现周期性的尿频、尿痛和尿血等[8，9]。子宫内膜异位症的确切发病机制尚不明确[10]，其主要治疗手段是药物和手术治疗[11]。药物治疗疗效不明显，易复发，有一定的不良反应发生[12]。本文在分析大鼠子宫内膜异位症发病的机制及米非司酮的改善作用时发现子宫内膜异位症模型组大鼠的TGFβ-Smad信号通路关键蛋白TGFβ、Smad1、Smad2及Smad3的表达均明显增高；促细胞凋亡蛋白Bax及Caspase-3表达增强而Bcl-2表达降低；米非司酮组大鼠的上述蛋白异常得到显著恢复，且大剂量组效果明显优于小剂量组。因此，米非司酮能够通过抑制孕激素的分泌，改变垂体促性腺细胞出现形态结构，阻断受体与孕酮结合并产生雌激素生物学效应[13]，抑制激活的TGFβ-Smad通路改善大鼠子宫内膜异位症的异常[14]，抗子宫内膜增殖[15]，诱导异位内膜发生变性、萎缩与坏死，治疗子宫内膜异位疗效显著，且不良反应小[16]。TGFβ-Smad信号通路参与了多种妇科疾病的病理学过程，且可以作为药物治疗的潜在靶点[17]。在研究Smad4在卵巢上皮癌组织中表达及意义的研究中发现Smad4蛋白可能与卵巢上皮癌的发展有一定的相关性[18]。在研究Smad4和MMP-9在卵巢上皮性癌组织中表达意义的研究中，也发现Smad4在卵巢上皮癌的发生发展中发挥着重要作用，且与基质金属蛋白酶9有密切的相关性，二者可以作为临床诊断卵巢上皮癌预后的重要参数[19]。在对TGFβ1的表达与宫颈癌相关性的研究中也证实TGFβ1的表达与宫颈鳞癌的发展呈明显的正相关性，且其可以作为宫颈癌早期诊断、治疗及预后的重要指标[20]。本文在分析子宫内膜异位症模型大鼠发病机制的研究中也发现模型组大鼠子宫内膜组织TGFβ及Smad1、Smad2和Smad3蛋白的表达明显高于假手术组，且差异有显著统计学意义；小剂量和大剂量的米非司酮组大鼠的上述蛋白异常得到明显改善，且与模型组相比差异有统计学意义，表明激活的TGFβ-Smad信号通路参与了大鼠子宫内膜异位症的发病过程，米非司酮能够通过抑制该信号通路的激活发挥改善作用。细胞凋亡是细胞的程序化死亡过程，也与妇科疾病的发病密切相关。本文也发现模型组大鼠子宫内膜组织Bax和Caspase-3蛋白的表达明显高于假手术组，而Bcl-2表达明显低于假手术组，且差异有显著统计学意义；小剂量和大剂量的米非司酮组大鼠的上述蛋白异常得到明显改善，且与模型组相比差异有统计学意义，表明细胞凋亡也参与了子宫内膜异位症的发生过程，且药物也能够通过抑制该过程发挥改善作用。

综上，米非司酮能够通过抑制激活的TGFβ-Smad通路改善大鼠子宫内膜异位症的異常。

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（收稿日期：2016-12-07）