一例猪蓝耳病的实验室诊断及NSP2、ORF5基因序列分析

李原野，李凤琴＊，徐志文，朱 玲

(1.西昌学院动物科学院，四川 西昌 615000，2.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130）

一例猪蓝耳病的实验室诊断及NSP2、ORF5基因序列分析

李原野1，李凤琴1＊，徐志文2，朱 玲2

(1.西昌学院动物科学院，四川 西昌 615000，2.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130）

为诊断四川眉山某猪场暴发的疑似猪蓝耳病。利用RT-PCR方法对其进行分子诊断，在确认为阳性结果的基础上针对PRRSV的ORF5和Nsp2基因分别设计特异性引物，扩增基因片段进行测序然后对其进行遗传进化分析。结果表明，该疫情由PRRSV引起，遗传进化分析表明该PPRSV毒株的ORF5和Nsp2无明显变异，现有防控措施有效。

猪繁殖与呼吸综合征；ORF5；Nsp2；RT-PCR诊断

猪蓝耳病亦称猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的猪繁殖障碍和呼吸道传染病，临床主要表现为妊娠母猪繁殖障碍，妊娠母猪流产、弱胎、死胎、木乃伊胎[1]；仔猪主要表现为间质性肺炎等症状[2]。本病于20世纪80年代在美国首次流行以来，迅速传遍世界主要养猪国家，中国于1995年发现该病[3]，是威胁我国当前养猪业持续健康发展的主要疫病之一，加强该病的分析研究和综合防控，对生猪生产稳定发展意义重大。2016年12月，四川眉山某猪场暴发疑似猪繁殖与呼吸综合征疫情，发病猪呼吸困难，剖检肺部病变明显，送至四川农业大学动物生物技术中心进行实验室检测。

1 材料与方法

1.1 临床样品采集

2016年12月，四川眉山某猪场发生疑似PRRS，主要表现为仔猪食欲减退、高热，体温41 ℃，轻微腹泻以及严重的呼吸道症状，剖检可见肺部间质性肺炎，全身淋巴结轻度水肿。通过临床特征和病理解剖初步判断为PRRS。采集发病猪血清以及肺脏、淋巴结和脾脏等组织冷藏保存，送实验室进行PRRSV的RT-PCR诊断。

1.2 主要仪器和材料

Mastercycler PCR 扩增仪（Eppendorf，德国）、Gel Doc 2000 凝胶图像分析系统（BIO-RAD，美国）、2×Taq Plus PCR MasterMix（含染料）购自天根生化科技（北京）有限公司，反转录试剂盒、TakaRaTaqDNA酶和DL 2 000 DNA Marker（宝生物工程大连有限公司）。

1.3 引物设计与合成

本实验所使用引物如表1所示，所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR检测及基因组序列扩增所使用引物

1.4 病料处理及RNA的抽提

取采集病料0．5～2．0 g 研磨，并按1∶3 比例加入生理盐水配成病料悬液，随后反复冻融3次。冻融后按12 000 r/min 离心5 min 后取上清液，按照Trizol法提取RNA，并将提取的RNA按照反转录试剂盒方法制成cDNA保存备用。

1.5 RT-PCR检测

取1μL cDNA于PCR管中，然后分别加入引物P1、P2和P3各10 pmol，2×PCR Master Mix 25μL，并补加无菌水至50μL，混匀后置PCR仪中按照以下程序进行扩增：95 ℃，1 min；95 ℃，5 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40个循环；72 ℃ 1 min； PCR结束后取5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。

1.6 Nsp2和ORF5基因扩增

以1．5反转录的cDNA为模板，分别加入Nsp2-1、Nsp2-2引物和ORF5-1、ORF5-2引物，2×PCR Master Mix 25μL，并补加无菌水至50μL，扩增Nsp2高变区和ORF5基因。

1.7 克隆与鉴定

PCR扩增结束后用1%琼脂糖凝胶电泳、电压100 V、30～50 min后观察结果，按照胶回收试剂盒说明书回收目的基因片段，与pMD19-T Simple Vector载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑取白色菌落，接种于LB液体培养基（Amp+）中培养后提取质粒，经NcoI、BamH I双酶切及PCR鉴定，阳性菌液保存备用。

1.8 序列测定及分析

将含目的DNA的阳性菌液送至宝生物工程（大连）有限公司进行测序。采用DNAStar软件（Version 7．0）对Nsp2基因、ORF5基因序列与GenBank中收录的PRRSV的Nsp2基因、ORF5 基因序列的核苷酸及氨基酸序列进行同源性分析，应用ClustalX、Mega 4．1 软件绘制进化树。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR检测结果

凝胶电泳检测，发现待检测样品扩增出一条180 bp的目的条带（如图1），而阴性对照样品没扩增出条带，此次发病猪为HP-PRRSV毒株感染。

2.2 Nsp2和ORF5基因片段的扩增

图1 病料检测结果

Nsp2和ORF5基因扩增凝胶电泳结果显示Nsp2扩增出一条约为1 100 bp大小的片段（如图2A），而ORF5扩增出一条约为564 bp大小的片段（如图2B）。

2.3 序列测定结果

将连接质粒测序后对序列进行拼接，将此次测序毒株命名为PRRSV SC-2016株。结果显示，Nsp2高变区序列长度为1 103 bp，ORF5序列长度为563 bp。分别将其与GenBank中收录的PRRSV毒株相应序列进行Blast比对。通过临近结合法（Neighbor-joining，NJ）分别构建SC-2016毒株及参考毒株的Nsp2和 ORF5遗传进化树，并且从遗传进化树分支来看，SC-2016株属Hp-PRRSV亚型。

2.4 SC-2016毒株的Nsp2、ORF5基因序列分析

系列分析结果表明：SC-2016毒株的Nsp2与GenBank中14种参考毒株的同源性在68．0%-83．1%之间（见图3），其中与北京株（2007-EU106888．1）、甘肃株（2006-EU236259．1）、广东株（2007-EU880433．2）、甘肃株（2008-EU880437．2）、北京株（2006-EF112445．1）、武汉株（2013-HM853673．2）、河北株（2012-JQ326271．1）的同源性在82．0%～83．1%之间。与北京株（2006-EF112445．1）、甘肃株（2006-EU236259．1）、甘肃株（2008-EU880437．2）、河北株（2012-JQ326271．1）的同源性最高，达82．9%～83．1%。

SC-2016毒株ORF5与GenBank中14种参考毒株的同源性在87．9%～99．8%之间（见图4），其中与北京株（2007-EU106888．1）、甘肃株（2006-EU236259．1）、广东株（2007-EU880433．2）、甘肃株（2008-EU880437．2）、武汉株（2013-HM853673．2）、河北株（2012-JQ326271．1）、北京株（2006-EF112445．1）的同源性均在98%以上。与武汉株（2013-HM853673．2）、河北株（2012-JQ326271．1）的同源性最高，达99．7%～99．8%。

2.5 SC-2016毒株的Nsp2、ORF5基因遗传发育树分析

SC-2016毒株的的Nsp2和GenBank中收录的14种代表毒株ORF5基因序列绘制系统发生树，通过比较发现与北京株（2006-EF112445．1）、甘肃株（2006-EU236259．1）、河北株（2012-JQ326271．1）关系较近（见图5）。

图4 ORF5基因同源性分析矩阵图

图5 Nsp2基因遗传进化树

图6 ORF5基因遗传进化树

SC-2016毒株的ORF5和GenBank中收录的14种代表毒株ORF5基因序列绘制系统发生树，通过比较发现与河北毒株（2012-JQ326271．1）关系较近（见图6）。

3 讨论与分析

PRRS在20世纪80年代暴发以来，目前已成为危害世界养猪业的主要疫病之一，给整个养猪业造成严重的经济损失。主要引起母猪流产、早产、死胎，断奶仔猪生长迟缓，且常常继发其他病原感染。目前世界各国都在积极采取多种预防措施，但是该病在世界范围内仍陆续暴发，甚至出现了更多的高致病毒株系，PRRSV不同分离株核苷酸序列存在广泛而明显的变异，而不同毒株的 PRRSV具有不同的抗原性，从而造成本病更加难以控制[4-5]。PRRSV感染猪群后，其发病临床特征和严重程度，取决于毒株、猪的年龄、继发其他细菌或病毒的感染情况。PRRSV毒株的毒力越强、感染猪的日龄越小、存在其他病原混合感染时，临床出现的病征就越严重，本场此次发生的PRRS疫情表现为发病猪临床病征较严重，鉴定结果表明此次感染毒株为高致病性蓝耳病毒株。

据资料表明，PRRSV通过碱基突变、缺失和基因重组发生变异，其中碱基突变最为多见[6]。高志强[7]等在2002年对HB-2(sh)毒株的全基因序列测定分析时首次发现PRRSV存在缺失变异现象，在NSP2和GP3基因上分别存在连续12个和1个氨基酸基因的缺失。越来越多的研究表明，PRRSV不同毒株的变异在整个基因组均有发生，但以Nsp2、ORF5变异程度最大[8-9]。因此，很多学者根据ORF5基因的变异情况研究病毒的遗传演化规律。在所有结构蛋白中，Nsp2为各毒株间差异较大的一个编码区，变异程度最高，并具有种特异性，在各毒株间存在较大的差异，这也为主要毒株的新的分类方法提供了依据。此次对PRRS SC-2016毒株分别将其与GenBank中收录的PRRSV毒株相应序列进行Blast比对。并对SC-2016毒株及参考毒株分别构建了Nsp2和ORF5的遗传进化树。

根据遗传分析结果可知，PRRSVSC-2016株的ORF5基因和Nsp2基因与2012年分离的河北毒株的亲缘关系最近。从遗传进化树分支来看，SC-2016株分属Hp-PRRSV亚型，基因分析表明四川眉山株的PRRSV病毒的变异度不大，在其生物学特性以及细胞嗜性、致病力等方面变化都不大。同时通过进化分析也发现，该病毒的序列略有变异，在日常防控工作中仍需加强PRRSV的监测，做好该病的分子生物学调查，分析研究该病原变异的趋势，对其致病机理和免疫机理进行深入研究分析，更加有效的根据变异提供有效的疫苗，以更好的防控该病。

[1] 闫军霞，毕孝瑞．猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2的研究进展[J]．中国兽医杂志，2013，49(6)：56-58．

[2] 陈溥言．兽医传染病学[M]．5版．北京：中国农业出版社，2006．

[3] 杜瑞玲，李银聚，张春杰．白条鸡传染性法氏囊病病毒RT-PCR检测方法的建立和初步应用[J]．中国动物检疫，2010，27(4)：30-32．

[4] GOLDBERGT L，HAHN E C，WEIGEL R M，etal．Genetic，geographical and temporal variation of porcine reproductive and respiratorysyndrome v i r u s i n I l l i n o i s[J]．J G e n Virol，2000，81：171-179．

[5] MENG X J．Heterogeneity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus：implications forcurrentvaccine efficacy and future vaccine development[J]．Vet Microbiol，2000，74(4)：309-329．

[6] 周海范，夏平安，崔保安，等．猪繁殖与呼吸综合症病毒河南分离株ORF5基因的克隆与变异分析[J]．中国兽医学报，2007，27（6）：810-813．

[7] 高志强，郭鑫，杨汉春，等．猪繁殖与呼吸综合征病毒缺失变异株的基因组特征[J]．畜牧兽医学报，2005，36（6）：578-584．

[8] MATEU E，DIAZ I，DAWICH L，etal．Evolution ofORF5 of Spanish porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains from 1991 to2005[J]．Virus Res，2006，115(2)：198-206．

[9] KIM W I，KIM J J，CHASH，etal．Different biological characteristics of wild-type porcine reproductive and respiratory syndrome viruses and vaccine viruses and identification of the corresponding genetic deteminants[J]．JC lin Microbiol，2008 46(5)：1758-1768．

[10] 张金强，吴家强，朱向福，等．PRRSV SX-1株的分离与NSP2基因和ORF5基因的克隆及变异分析[J]．家畜生态学报，2009（5）：24-28．

2017-03-09)

四川省科技支撑计划（2014NZ0043），国家“十二五”科技支撑计划（2015BAD12B04-2.3）

李原野（1993-），女，四川人，在读硕士研究生，主要从事动物传染病病原分子生物学方向的研究

*通讯作者：李凤琴，Tel：0835-2885846， E-mail： 410726908@ qq.com