间充质干细胞诱导分化为肺泡上皮细胞治疗急性呼吸窘迫综合征研究进展

陈钦桂 曾勉

间充质干细胞诱导分化为肺泡上皮细胞治疗急性呼吸窘迫综合征研究进展

陈钦桂 曾勉

以高死亡率著称的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是呼吸与重症医学领域亟需攻克的难题之一。来源广泛、体外易扩增培养的间充质干细胞（MSC）有望为ARDS的治疗提供新的有效手段。已有较多的相关研究显示了MSC治疗ARDS的有效性，而通过分化为肺泡上皮细胞修复损伤肺组织可能是其治疗机制之一。本文对MSC诱导分化为肺泡上皮细胞及其应用于治疗ARDS的研究进展进行综述，以期为该领域相关工作者提供一定的借鉴与启示。

间质干细胞； 肺泡； 上皮细胞； 急性病； 呼吸窘迫综合征

急 性 呼 吸 窘 迫 综 合 征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是临床上较常见的急危重症，尽管对其治疗的认识与手段不断革新，但目前尚以支持性治疗为主，故其死亡率一直居高不下，仍高达30﹪～ 50﹪[1-2]。因此探索新的有效治疗策略，特别是针对ARDS发病环节的治疗方法，显得必要而迫切。ARDS的本质是过度的炎症反应对肺实质的损伤，尤其是对构成血气屏障的肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞的损伤[3-4]。因此，更新修复肺泡上皮细胞可能是治疗ARDS的一种有效策略，而最有应用前景的无疑是具有自我更新和多向分化潜能的干细胞。已有大量临床前试验及少量临床试验证实了干细胞治疗ARDS的潜在价值，其中又以来源广泛、易分离培养的间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）最为瞩目[5]。作为MSC发挥治疗作用的可能机制之一，诱导MSC向肺泡上皮细胞分化是该领域研究热点之一。本文主要综述近几年诱导MSC分化为肺泡上皮细胞的研究进展及该策略在应用于治疗ARDS时尚存在的一些问题。

一、MSC可分化为肺泡上皮细胞并在ARDS治疗中发挥作用

肺泡与血液进行气体交换有赖于结构完整的血气屏障，尽管ARDS的发病机制尚未完全明确，目前认为其本质是由多种危险因素引发的肺脏炎症反应，以弥漫性损伤血气屏障为主要特征[6]。MSC作为成体干细胞，具有强大的增殖能力、多向分化潜能以及低免疫原性[7]，是可能用于修复组织器官损伤的理想种子细胞。尽管目前已有较多证据显示外源性移植的MSC可分化为肺泡上皮细胞，但在该领域研究的早期，这一观点并未能被普遍接受。Albera等[8]通过免疫荧光标记观察到肺上皮可通过骨髓来源的干细胞得到更新，有学者[9]对此表示质疑，认为MSC移植后并不能分化为肺泡上皮细胞，而是某些细胞自发荧光导致了免疫荧光的假阳性。随着细胞追踪等方法学的发展与完善，后续的相关研究基本排除了假阳性的可能。Zhao等[10]通过尾静脉注射DAPI标记的骨髓间充质干细胞（born mesenchymal stem cell，BMSC）研究其对博来霉素介导大鼠肺损伤模型的治疗作用，发现输注后1、2、4周均可于肺组织发现少量标记的BMSC，而支气管壁仅在第2周可观察到，但二者均同时表达广谱细胞角蛋白，与对照组相比MSC治疗组肺组织损伤明显减轻，认为外源性的BMSC可在损伤的大鼠肺组织中分化为肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞，从而发挥治疗作用。Wang等[11]在脂多糖介导肺损伤小鼠模型中亦有类似发现。可见，MSC可分化为肺泡上皮细胞并在ARDS治疗中发挥作用。

二、诱导MSC分化为肺泡上皮细胞的方法

尽管MSC可向肺泡上皮细胞分化，但不同研究中分化效率不一，且若要真正应用于临床，需要大量的MSC及高效率的诱导分化策略，因此探索及优化MSC诱导分化为肺泡上皮细胞的方法深受关注。目前研究较多的诱导方法主要是采用小气道上皮细胞生长培养基、共培养以及基因修饰（表1）。

1.小气道上皮细胞生长培养基：小气道上皮细胞生长培养基主要是在常规的细胞培养基中添加一些能促进MSC向肺泡上皮细胞分化的物质，如某些生长因子、激素等，但不同研究添加的培养基成分有所差异。Li[12]将人BMSC在添加了角化细胞生长因子、转铁蛋白、三碘甲腺原氨酸等的培养基中培养，诱导其分化为Ⅱ型肺泡上皮细胞（ATⅡ），并将这些诱导分化的ATⅡ移植入环孢素A介导的肺损伤小鼠模型，发现其比人BMSC具有更高的修复肺损伤能力。Yan等[13]添加的则是胰岛素生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子。而Li等[14]则先用KOSR（KnockOutTMserum replacement，一种商品化的无血清培养基）和激活素A处理人羊水来源间充质干细胞（AFSC），再在SAGM（small airway basal medium，Lonza公司生产的一种的小气道上皮细胞生长培养基）中培养实现诱导分化。

2.共培养：共培养主要是将MSC与受损伤的肺泡上皮细胞或肺组织匀浆等共同培养，实现诱导分化的目的。Maria等[15]将大鼠BMSC与正常肺组织或辐射损伤的肺组织细胞在添加了小气道上皮细胞生长试剂盒（small airway epithelial cell growth kit）中共培养，发现与正常肺组织细胞相比，损伤的肺组织细胞可诱导更高比例的BMSC表达ATⅡ的表面标志蛋白，且肺组织损伤程度越严重，诱导能力越强。Gao等[16]将大鼠BMSC与肺组织匀浆在常规培养基中共培养，发现添加了丹酚酸B与添加Wnt3a一样可促进BMSC分化为Ⅰ型肺泡细胞（ATⅠ），认为与激活Wnt通路有关。Liu等[17]则通过Transwell小室构建BMSC与MLE-12细胞（一种小鼠肺上皮细胞）在SAGM中的共培养系统，诱导其向ATⅡ分化。

3.基因修饰：基因修饰诱导分化的基本原理是通过调控某些与MSC分化方向有关的基因表达水平，从而促进其向肺泡上皮细胞分化。Cai等[18-19]先后通过转染慢病毒转染使小鼠BMSC高表达β-catenin或Wnt5a的受体ROR2（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2），并将其移植到脂多糖介导的肺损伤小鼠中，发现其比未修饰的BMSC有更高的分化为ATⅡ能力，且其向肺组织归巢、肺组织停留时间均更高。

表1 不同研究诱导MSC分化为肺泡上皮细胞的方法

细胞的分化是基因选择性表达的结果，因此诱导MSC向肺泡上皮细胞分化的关键是对基因表达的调控。无论是添加多种生长因子等物质的小气道上皮细胞生长培养基，还是与受损肺组织细胞共培养，抑或是在基因水平进行干预，均是通过对基因表达的调控实现诱导分化，所不同的只是前两者是通过构建特殊的微环境间接地进行调控，而基因修饰则是直接的调控。

三、影响MSC分化方向的可能因素

（一）MSC的种类

作为中胚层的一类多能干细胞，MSC主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富。目前已可从骨髓、脂肪、肌肉、脐带、胎盘以及多种器官组织中分离获取MSC，这是应用MSC治疗ARDS的一个优点，但同时带来了一个问题，即不同来源的MSC对ARDS的治疗能力是否有差异，或者说什么来源的MSC是用于治疗的最佳选择。具体到分化能力上，目前尚无在同一研究中同时比较多种来源的MSC诱导分化为肺泡上皮细胞的效率差异。而不同研究间由于具体诱导条件、方法并不完全一致，相互之间往往缺乏可比性。

MSC具有异质性已是目前学术界主流的认识。研究发现，同样是人骨髓来源的MSC，不同个体来源或同一个体的不同亚群MSC，在增殖、分化的表现上存在差异，不利于工业化生产以及应用于临床[23]。显然，当前仅有的人MSC鉴定标准（2006年的ISCT标准）[24]尚有缺陷，方兴未艾的单细胞分析技术或许有望用于该问题的解决[25]。值得注意的是，存在于肺组织中的MSC——肺固有间充质干细胞（lung resident mesenchymal stem cell，LR-MSC）表现出强烈的肺组织特异性，正在受到越来越多的关注与研究，有望成为肺部疾病细胞疗法的选择之一[26]。

（二）MSC所处的微环境

如前所述，MSC所处微环境可影响其分化方向。Yan等[13]研究BMSC移植时机对其分化方向的影响，发现肺损伤模型建立后立即移植的BMSC可分化为肺泡上皮细胞或血管内皮细胞，而若于损伤后2个月再移植，则BMSC大部分停留在肺间质并向肌纤维细胞分化，认为与微环境特别是TGF-β1有关。

（三）基因或信号通路的调控

1.Wnt通路：Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络，研究显示Wnt/β-catenin信号通路在肺的发育过程中起着重要调控作用[27]，故在MSC诱导分化的研究中对该通路关注较多。

国内邱海波团队[17,19,28]对Wnt通路与MSC分化的研究较深入，先后通过添加经典Wnt通路激活剂Wnt3a或LiCl或慢病毒转染过表达β-catenin证实激活Wnt/β-catenin信号通路可促进MSC分化为ATⅡ，通过添加Wnt5a证实Wnt/JNK和Wnt/PKC通路也有类似作用。Shi等[29]在大鼠脂肪来源的间充质干细胞亦有类似发现。组蛋白去乙酰酶（histone deacetylases，HDACs）可通过使组蛋白去乙酰化修饰染色质结构，从而影响基因表达。Wang等[30]在研究肺的发育中发现，敲除HDAC3的小鼠出现ATⅠ严重发育障碍，且伴随着肺泡上皮细胞Wnt/β-catenin信号通路的抑制，而激活Wnt/β-catenin信号通路可部分逆转该影响，认为HDAC3通过调节Wnt/β-catenin信号通路在ATⅠ的发育中其重要作用。

然而，亦有研究得出相反的结论。Sun等[31]在对HCl介导的肺损伤大鼠研究中发现，使用Dickkopf-1（DKK1）抑制经典Wnt/β-catenin信号通路可促进BMSC向肺泡上皮细胞分化，而使用Wnt3a激活该通路反而促进BMSC向肌成纤维细胞或成纤维细胞方向分化。Wang等[32]在博来霉素介导的肺损伤模型中也有类似结论。这或许与肺损伤的模型差异有关，不同的肺损伤模型使移植入体内的BMSC处于不同的微环境，导致同一通路对其分化方向的影响出现差异，但需要进一步的实验提供证据。

2.其他：除了研究较多的Wnt通路，在对肺的形成与发育研究中发现的一些转录因子也可能影响MSC的分化，有望成为干预MSC分化方向的靶点，尽管可能目前尚无直接相关的研究。Tbx2基因在肺的发育中有重要作用。Ludtke等[33]观察到敲除了Tbx2基因的小鼠出现远端肺部发育障碍，肺泡上皮细胞特别是ATⅠ增殖受阻，伴随着Cip/Kip细胞周期抑制家族成员Cdkn1a（p21）和Cdkn1b（p27）活动增强。而敲除这两个基因在很大程度上可逆转肺部发育障碍。通过ChIP技术确认了Tbx2可与Cdkn1a（p21）和Cdkn1b（p27）两个基因位点直接结合，提示Tbx2通过调控Cdkn1a（p21）和Cdkn1b（p27）的表达而实现对肺发育的调控。因此，干预Tbx2可能影响MSC分化方向。Sox9是另一个与肺的形成与发育密切相关的转录因子，特别是在分化为ATⅠ、ATⅡ的启动有重要调控作用，起着平衡增殖与分化的功能，且该过程与Wnt/β-catenin信号通路不相关[34]。Nyeng等[35]发现Fgf10可抑制肺泡上皮细胞的分化，促进胚肺远移生长，过表达Fgf10的肺泡上皮细胞呈现出类似于其祖细胞的增殖表现及表面标志，提示Fgf10可能参与调控肺泡上皮细胞的分化方向。

四、MSC诱导分化策略在治疗ARDS中存在的问题

虽然已有较多的相关研究证实了MSC治疗ARDS的有效性，但关于其治疗机制却仍有争议。传统的观点认为，MSC通过归巢到损伤的肺组织并分化为肺泡上皮细胞或肺微血管内皮细胞，直接修复血气屏障，从而发挥治疗ARDS的作用。该机制的实现需要两个必要的环节，即MSC迁移到损伤的肺组织，以及分化修复损伤的细胞。Song等[36]利用生物发光显像技术追踪人BMSC移植入裸鼠后的去向，发现移植后BMSC最初均出现在肺部，7.5 h达到顶峰，不同的是与健康裸鼠相比，吸烟介导肺损伤的裸鼠肺部细胞信号更强、停留时间更长，但均在5 d后信号消失。在如此短的时间内MSC是否可分化为受损的细胞，确实存疑。也正因为如此，如何促进MSC向肺组织归巢是MSC治疗ARDS研究中的另一个热点，目前主要通过调节归巢相关的趋化因子、黏附分子或生长因子的配体（受体）表达水平来实现，已有学者[37]进行相关介绍，此处不再赘述。而关于MSC诱导分化为肺泡上皮细胞，仍有不少问题需要解决，如最佳的MSC组织来源、如何解释不同研究结果的差异甚至矛盾、如何提高诱导分化效率、基因修饰产生的安全风险等。尽管当前主流的观点倾向于认为旁分泌机制而非分化修复机制才是MSC的主要治疗机制[7,38]，但这不应该成为减缓或停止MSC诱导分化相关研究的理由，因为无论是对于继续深入揭示ARDS发病机制，还是对于寻求新的有效修复肺损伤的途径，乃至对于有朝一日人类能实现再生肺脏的梦想，都离不开对MSC向肺泡上皮细胞诱导分化的研究。换言之，该领域的研究不仅对呼吸与重症医学具有重要意义，还能促进再生医学的发展。相信随着研究技术的进步以及相关研究的深入，通过诱导MSC分化为肺泡上皮细胞，将为人类攻克ARDS带来希望。

1 Bellani G, Laffey JG, Pham T, et al.Epidemiology, patterns of care, and mortality for patients with acute respiratory distress syndrome in intensive care units in 50 countries[J].JAMA, 2016, 315(8)：788-800.

2 耿申, 吴婷, 穆先敏, 等.细胞间黏附分子-1在ARDS小鼠肺微血管内皮细胞内的表达变化[J].医学研究生学报, 2016(04)：342-347.

3 Han S, Mallampalli RK.The acute respiratory distress syndrome： from mechanism to translation[J].J Immunol, 2015, 194(3)：855-860.

4 王凡, 韩志海.炎症介质在海水淹溺急性肺损伤发生机制中的作用[J].转化医学杂志, 2015(05)：311-315.

5 Horie S, Masterson C, Devaney J, et al.Stem cell therapy for acute respiratory distress syndrome： a promising future?[J].Curr Opin Crit Care, 2016, 22(1)：14-20.

6 Sweeney RM, McAuley DF.Acute respiratory distress syndrome[J].Lancet, 2016, 388(10058)：2416-2430.

7 Walter J, Ware LB, Matthay MA.Mesenchymal stem cells： mechanisms of potential therapeutic benefit in ARDS and sepsis[J].Lancet Respir Med, 2014, 2(12)：1016-1026.

8 Albera C, Polak JM, Janes S, et al.Repopulation of human pulmonary epithelium by bone marrow cells： a potential means to promote repair[J].Tissue Eng, 2005, 11(7-8)：1115-1121.

9 Kotton DN, Fabian AJ, Mulligan RC.Failure of bone marrow to reconstitute lung epithelium[J].Am J Respir Cell Mol Biol, 2005, 33(4)：328-334.

10 赵峰, 李圣青, 张宇飞, 等.骨髓间充质干细胞在肺损伤大鼠肺组织的分化[J].解放军医学杂志, 2007, 32(2)：131-133.

11 Wang W, Qian LL, Liu HP, et al.Engraftment of bone marrow stromal cells in lipopolysaccharide-injured mouse lungs[J].Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi, 2009, 11(5)：321-327.

12 Li JD.Directed differentiation of airway epithelial cells of human bone marrow mesenchymal stem cells[J].Artif Cells Nanomed Biotechnol, 2016, 44(7)：1654-1658.

13 Yan X, Liu Y, Han Q, et al.Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung[J].Exp Hematol, 2007, 35(9)：1466-1475.

14 Li Y, Xu W, Yan J, et al.Differentiation of human amniotic fluidderived mesenchymal stem cells into type II alveolar epithelial cells in vitro[J].Int J Mol Med, 2014, 33(6)：1507-1513.

15 Maria OM, Maria AM, Ybarra N, et al.Mesenchymal stem cells adopt lung cell phenotype in normal and radiation-induced lung injury conditions[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2016, 24(4)：283-295.

16 Gao P, Yang J, Gao X, et al.Salvianolic acid B improves bone marrowderived mesenchymal stem cell differentiation into alveolar epithelial cells type I via Wnt signaling[J].Mol Med Rep, 2015, 12(2)：1971-1976.

17 Liu AR, Liu L, Chen S, et al.Activation of canonical wnt pathway promotes differentiation of mouse bone marrow-derived MSCs into type II alveolar epithelial cells, confers resistance to oxidative stress, and promotes their migration to injured lung tissue in vitro[J].J Cell Physiol, 2013, 228(6)：1270-1283.

18 Cai SX, Liu AR, Chen S, et al.The Orphan receptor tyrosine kinase ROR2 facilitates MSCs to repair lung injury in ARDS animal model[J].Cell Transplant, 2016, 25(8)：1561-1574.

19 Cai SX, Liu AR, Chen S, et al.Activation of Wnt/beta-catenin signalling promotes mesenchymal stem cells to repair injured alveolar epithelium induced by lipopolysaccharide in mice[J].Stem Cell Res Ther, 2015, 6：65.

20 Cerrada A, de la Torre P, Grande J, et al.Human decidua-derived mesenchymal stem cells differentiate into functional alveolar type II-like cells that synthesize and secrete pulmonary surfactant complexes[J].PLoS One, 2014, 9(10)：e110195.

21 Mendez JJ, Ghaedi M, Steinbacher D, et al.Epithelial cell differentiation of human mesenchymal stromal cells in decellularized lung scaffolds[J].Tissue Eng.Part A, 2014, 20(11-12)：1735-1746.

22 Berger MJ, Adams SD, Tigges BM, et al.Differentiation of umbilical cord blood-derived multilineage progenitor cells into respiratory epithelial cells[J].Cytotherapy, 2006, 8(5)：480-487.

23 Phinney DG.Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells：implications for cell therapy[J].J Cell Biochem, 2012, 113(9)：2806-2812.

24 Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy, 2006, 8(4)：315-317.

25 Wilson NK, Kent DG, Buettner F, et al.Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations[J].Cell Stem Cell, 2015, 16(6)：712-724.

26 Collins JJ, Thebaud B.Progenitor cells of the distal lung and their potential role in neonatal lung disease[J].Birth Defects Res A Clin Mol Teratol, 2014, 100(3)：217-226.

27 Zhang M, Shi J, Huang Y, et al.Expression of canonical WNT/beta-CATENIN signaling components in the developing human lung[J].BMC Dev Biol, 2012, 12：21.

28 Liu A, Chen S, Cai S, et al.Wnt5a through noncanonical Wnt/JNK or Wnt/PKC signaling contributes to the differentiation of mesenchymal stem cells into type II alveolar epithelial cells in vitro[J].PLoS One, 2014,9(3)：e90229.

29 石莉, 竭晶, 王芳, 等.Wnt信号途径促进脂肪间充质干细胞向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化[J].中国组织工程研究, 2015, 19(32)：5148-5154.

30 Wang X, Wang Y, Snitow ME, et al.Expression of histone deacetylase 3 instructs alveolar type I cell differentiation by regulating a Wntsignaling niche in the lung[J].Dev Biol, 2016, 414(2)：161-169.

31 Sun Z, Gong X, Zhu H, et al.Inhibition of Wnt/beta-catenin signaling promotes engraftment of mesenchymal stem cells to repair lung injury[J].J Cell Physiol, 2014, 229(2)：213-224.

32 Wang C, Zhu H, Sun Z, et al.Inhibition of Wnt/beta-catenin signaling promotes epithelial differentiation of mesenchymal stem cells and repairs bleomycin-induced lung injury[J].Am J Physiol Cell Physiol, 2014, 307(3)：C234-C244.

33 Ludtke TH, Farin HF, Rudat C, et al.Tbx2 controls lung growth by direct repression of the cell cycle inhibitor genes Cdkn1a and Cdkn1b[J].PLoS Genet, 2013, 9(1)：e1003189.

34 Rockich BE, Hrycaj SM, Shih HP, et al.Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110(47)：E4456-E4464.

35 Nyeng P, Norgaard GA, Kobberup S, et al.FGF10 maintains distal lung bud epithelium and excessive signaling leads to progenitor state arrest, distalization, and goblet cell metaplasia[J].BMC Dev Biol, 2008, 8：2.

36 Song M, Lv Q, Zhang X, et al.Dynamic tracking human mesenchymal stem cells tropism following smoke inhalation injury in NOD/SCID mice[J].Stem Cells Int, 2016, 2016：1691856.

37 黄丽丽, 徐秀萍, 张曦文, 等.间充质干细胞向肺组织归巢在ARDS治疗中的研究进展[J].中华医学杂志, 2016, 96(13)：1063-1065.

38 Li B, Zhang H, Zeng M, et al.Bone marrow mesenchymal stem cells protect alveolar macrophages from lipopolysaccharide-induced apoptosis partially by inhibiting the Wnt/beta-catenin pathway[J].Cell Biol Int, 2015, 39(2)：192-200.

Advances in research of induced differentiation of mesenchymal stem cells into alveolarepithelial cells for treatment of ARDS

Chen Qingui, Zeng Mian.Medical Intensive Care Unit, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China

Corresponding author: Zeng Mian, Email: zengmian2004@163.com

Acute respiratory distress syndrome（ARDS）, which is notorious for its high mortality rate, is one of the greatest challenges in the field of respiratory and critical care medicine.Mesenchymal stem cell（MSC）, which is readily available and easily expandable in vitro, is considered to be a promising therapy for ARDS.Numerous studies have shown the effectiveness of MSC in the treatment of ARDS.Although the mechanism is not completely understood, differentiation of MSC into alveolar epithelial cells to repair injured lung tissue may be one of the possible mechanisms.Herein, research progress of induced differentiation of MSC into alveolar epithelial cells and its application in the treatment of ARDS is reviewed.

Mesenchymal stem cells; Pulmonary alveoli; Epithelial cells; Acute disease; Respiratory distress syndrome

2017-01-10）

（本文编辑：蔡晓珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.02.011

国家自然科学基金(81670066)；广东省省级科技计划项目(2016A020216009)

510080 广州，中山大学附属第一医院内科重症监护病房

曾勉，Email：zengmian2004@163.com

陈钦桂，曾勉.间充质干细胞诱导分化为肺泡上皮细胞治疗急性呼吸窘迫综合征研究进展[J/CD].中华细胞与干细胞杂志（电子版），2017，7（2）：124-128.