大通县流产胎儿中病原菌的分离鉴定及系统发育树分析

李稳欣，张学勇，徐 龙，郭志宏，马利青

（青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016）

大通县流产胎儿中病原菌的分离鉴定及系统发育树分析

李稳欣，张学勇，徐 龙，郭志宏，马利青

（青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016）

从送检的流产胎儿病料中，分离培养得到2株致病菌，经生化试验、药物敏感性试验和分子生物学鉴定，分离菌株为致病性大肠杆菌。体外药物敏感性试验显示，该菌对红霉素、多黏菌素B和多黏菌素E敏感；对杆菌肽中度敏感；对青霉素、四环素、阿莫西林等耐药。说明此次引起该猪场流产的主要原因为致病性大肠杆菌感染。

仔猪；分离；鉴定；大肠杆菌

大肠埃希氏菌（Escherichia coil,E.coil）常称为大肠杆菌，属革兰氏阴性短杆菌，研究初期认为该菌为肠道正常菌群，随着研究的深入，该菌被证实对人和动物有一定的致病性，尤其婴儿和幼畜最易感染，常引起腹泻和败血症，每年由该菌引起疾病的发病率和病死率很高，严重威胁人类和养殖业健康有序发展[1]。

2016年12月，青海省大通县某养殖猪场母猪出现流产现象，母猪产死胎、弱胎。多数新生仔猪消瘦，弓背，被毛杂乱，腹泻，排出白色或灰白色粥样粪便，并伴有腥臭味。随后将流产胎儿送检至青海省畜牧兽医科学院生物技术研究室要求确诊病因。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 来自青海省西宁市大通县某猪场流产胎儿3份。命名1号、2号和3号病料。

1.1.2 主要培养基及仪器设备 普通营养肉汤购自于北京索莱宝科技有限公司；普通营养琼脂平板、鲜血平板培养基和厌气肉肝汤，自制；麦康凯、伊红美蓝、三糖铁和MH培养基购自于青岛高科园海博生物技术有限公司；药敏片购自于Oxoid公司；DNA提取试剂盒购自于天根生化科技（北京）有限公司；PCR仪购自于杭州晶格科学仪器有限公司；PCR所用试剂及预混酶购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 试验动物 昆明系小鼠6只，雌雄各半，6～8周，体重15～18g，购自青海省地方病研究所试验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离培养 将流产胎儿的心脏、肝脏、脾脏、脏肺、肾脏和胃内容物等病料分别接种至普通营养肉汤、鲜血平板和厌气肉肝汤中，37℃恒温培养24 h，观察菌落形态及培养特性。挑选具有溶血现象的单个菌落，分别接种到普通营养肉汤和鲜血平板，37℃纯化培养24 h，观察菌株在各个培养基上的生长情况，并将培养物涂片、染色镜检，观察培养物的形态学特征和一致性。

1.2.2 生化特性鉴定 对分离菌株进行氨基酸生化管（鸟氨酸、赖氨酸）、山梨醇、尿素、硫化氢、糖微量发酵管（棉子糖、葡萄糖、木糖）、蛋白胨水、半固体琼脂、侧金盏花醇、葡磷胨水和枸橼酸盐管等试验。37℃，培养24 h，观察并记录结果。

1.2.3 动物致病性试验 将有溶血现象，且纯化的菌株，接种至普通营养肉汤培养18 h后，经腹腔，注射给2只试验小鼠，剂量为0.2 mL/只，另取2只小鼠做阴性对照，每只腹腔注射0.2 mL普通营养肉汤；统一饲养，观察记录试验小鼠的精神状态、饮食及存活等情况。对死亡小鼠进行剖解，无菌采取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等组织接种至鲜血平板培养基，37℃，培养24 h，对溶血菌落进行染色镜检。观察生长特性、形态特征与接种菌株的一致性。

1.2.4 PCR鉴定 提取分离菌株基因组DNA，用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增。PCR扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；60℃退火45 s；72℃延伸2 min 10 s，循环35次，最后72℃ 10 min。扩增后的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后收集条带，送往测序公司进行测序。引物信息及PCR扩增优化体系详见表1和表2。

表1 引物及序列

表2 PCR反应体系

1.2.5 系统发育分析 通过测序获得序列信息，利用DNA star软件拼接序列后，利用在线“BLAST”工具，对序列进行同源性比对，并运用MEGA 5.0软件自展1 000次构建系统发育树。

1.2.6 药敏试验 参照我国卫生行业最新标准和美国临床和实验室标准化协会标准CLSL M100，采用K-B纸片扩散法，将菌悬液均匀涂布于MH培养基上，用无菌镊子放置4～5片抗生素药敏片，37℃，孵育24 h，测定抑菌圈直径，根据有无抑菌圈及抑菌圈直径大小判断分离菌对各种药物的敏感程度。

2 结果与分析

2.1 培养特性及镜检结果

3份流产胎儿的胃内容物接种至普通营养肉汤、鲜血平板和厌气肉肝汤中，经37℃恒温培养24 h，普通营养肉汤和厌气肉肝汤均匀混浊；接种鲜血平板上的1号和2号病料胃内容物的有灰白色、光滑、边缘整齐并隆起的大菌落，呈明显β溶血，3号病料没有溶血菌落。2株分离菌株接种三糖铁培养基上，培养后底部均变黑，表明产生硫化氢；伊红美蓝培养基上为金属色菌落，中等大小；麦康凯培养基上为枚红色菌落，经革兰氏染色镜检均为革兰氏阴性短杆菌，镜检结果详见图1。

图1 革兰氏阴性短杆菌（100×）

2.2 分离株的生化特性

2株分离菌株均能分解葡萄糖产气；发酵棉子糖、木糖和乳糖；分解山梨醇、鸟氨酸和赖氨酸。具体生化特性见表3。

表3 2株分离菌株的生化特性

2.3 动物致死试验结果

将培养24 h的培养物注射给2只试验组小鼠后，2只试验组小鼠均在24 h内死亡。对照组小鼠生长发育正常。解剖死亡小鼠，发现肝脏稍肿大，脾脏肿大，肺脏边缘出血，肠壁变薄内含黄色黏性物质。从死亡小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中分离培养细菌，其生长特性、形态特征与接种菌株一致。

2.4 PCR鉴定结果

以分离菌株基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增，结果显示2株分离菌株均在1 486 bp左右处有清晰条带，与预期条带大小相符，详见图2。

图2 分离菌株16S rRNA扩增结果

2.5 序列比对及系统发育树分析

阳性样品测序自编号为D1F2017，与GenBank中已发表大肠杆菌序列进行比对，系统发育树分析显示D1F2017与印度蝙蝠粪样品中分离出的大肠杆菌（登录号为KT260462）的亲缘关系较近，同源性达99%，详见图3。

图3 分离菌株系统发育树

2.6 药敏试验结果

为进一步了解猪源中大肠杆菌的耐药谱，筛选出高敏药物，为兽医临床用药提供理论参考，减少抗生素滥用。药敏试验结果表明：分离菌对红霉素、多黏菌素B和多黏菌素E敏感；对杆菌肽中度敏感；对青霉素、四环素、阿莫西林等耐药，详见表4。

表4 分离株的药敏试验结果

3 小结与讨论

从送检的流产胎儿病料中，分离培养得到2株致病菌，经生化试验、药物敏感性试验和分子生物学检测，鉴定分离菌株为致病性大肠杆菌。根据药物敏感性图谱，建议使用红霉素敏感药物对母畜进行临床治疗，经治疗后，很快控制了疫情。

同时，我们对送检样品进行了伪狂犬病病毒、圆环病毒2型、蓝耳病病毒和猪瘟病毒核酸的检测，均未检出可疑条带。

应该对耐药菌株引起重视，这可能与饲养过程中长期添加抗菌药物有关。这些耐药菌株可垂直传播和水平传播，对人类和公共卫生学安全构成潜在的威胁[3-4]。因此，合理使用抗菌药物，掌握本地区菌株的抗药谱是十分有必要的[5-9]。

从系统发生树可以看出，本次分离的菌株和印度文献发表的从蝙蝠粪中分出的大肠杆菌的同源性相近（99%）。因此，保持圈舍环境卫生，防止圈养家畜和外界野生动物接触，减少病原菌的相互传播。同时，加强对产前母猪的饲养管理，给母猪提供充足的营养，提高仔猪出生的免疫力。保证产房清洁干燥，注意消毒。分娩舍、保育舍遵守“全进全出”和“空栏消毒、间歇一周”的原则。吃足初乳和生态制剂，保证新生仔猪的营养平衡[10]。

[1] 展天松，王彦红，许梦怡，等.肠致病性大肠杆菌的分离鉴定和耐药性分析[J].黑龙江畜牧兽医，2015（2）：67-69.

[2] 任梅渗，王印，杨泽晓，等.猪源奇异变形杆菌的分离鉴定与生物学分析[J].中国人兽共患病学报，2015，31（12）：1093-1097.

[3]刘艳红，李颖，吕淑霞.沙门氏菌和大肠杆菌耐药性的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，2016（10）：88-90.

[4]汤景元，王红宁，张鹏举，等.95个猪场大肠杆菌耐药表型及氨基糖苷类药物耐药基因型调查[J].畜牧兽医学报，2008，39（4）：472-477.

[5]Lu L M,Lei D,Yang W,et al.Characterization of antimicrobial resistance and integrons among Escherichia coli isolated from animal farms in Eastern China[J].Acta Tropica,2010,113(1):20.

[6]Lanz R,Kuhnert P,Boerlin P.Antimicrobial resistance and resistance gene determinants in clinical Escherichia coli from different animal species in Switzerland[J].Veterinary Microbiology,2003,91(1):73-84.

[7] 贡嘎，王刚，拉珍，等.西藏牦牛大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药性分析[J].中国兽医杂志，2014，50（8）：80-82.

[8] 陈朝喜，张郁，西格基.患病牦牛源大肠杆菌对10种不同抗菌药物敏感性试验 [J].西南民族大学学报（自然科学版），2014，40（1）：20-23.

[9] 鲁志平，曾群辉.西藏牦牛大肠埃希氏菌生物学特性的研究[J].西藏科技，2009（11）：27-30.

[10]余建荣，程传福，马圣利.仔猪大肠杆菌病的诊断与防治[J].现代农业科技，2016（12）：275.

（编辑：郭玉翠）

Isolation,Identification and Phylogenetic Analysis of Pathogen from Piglets Samples of Datong County

LI Wenxin,ZHANG Xueyong,XU Long,GUO Zhihong,MA Liqing
(Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine,Xining 810016,China)

Two pathogenic bacterias were isolated from clinical died abortion piglets samples.The result showed that the isolated strains were Escherichia coli strains,which were identified by biochemical tests,drug sensitivity tests and molecular methods.Drug sensitivity experiment showed that the separated strains were sensitive to Erythromycin,Polyadherin B and Polyadherin E.Moderate sensitivity to Bacitracin.Drug resistance to Penicillin, Tetracycline and Amoxicillin.The study showed that the Escherichia coli strains were the main pathogeny which causes the sow abortion.

piglets;isolation;identification;Escherichia coli

S858.285.1

A

1002-1957(2017)02-0097-03

2017-02-14

国家农业产业技术体系（CARS-40-4B）

李稳欣（1989-），女，河南开封人，在读硕士研究生，研究方向为预防兽医学.E-mail：1531395936@qq.com

马利青（1967-），男，研究员，主要从事动物疾病的诊断和防治研究工作.E-mail：maliq67@hotmail.com