猪链球菌病原的分离鉴定与药敏试验

刘志科，张秋雨，陈创夫

（1.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003；2.河南科技学院动物科学学院，河南 新乡 453003）

猪链球菌病原的分离鉴定与药敏试验

刘志科1，张秋雨2，陈创夫1

（1.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003；2.河南科技学院动物科学学院，河南 新乡 453003）

试验对河南某猪场的病猪通过临床观察及剖检病变初步怀疑为链球菌病。无菌采集病料送到实验室中进行细菌分离培养、生化试验鉴定、革兰氏染色和动物致病性试验，以及根据猪链球菌的cps1基因设计引物进行PCR反应有扩增目的条带，确诊为该病。并对分离出的猪链球菌进行药敏试验，结果表明该菌对泰乐菌素、丁胺卡那、环丙沙星和头孢氨苄唑啉钠为高度敏感；对青霉素、强力霉素和卡那霉素等抗生素药物为中度敏感；对磺胺二甲氧嘧啶、磺胺六甲氧嘧啶有明显的耐药性，由此可见试验分离的猪链球菌野毒株对不同药物的敏感性存在着一定差异。该研究对养殖户和兽医工作者在诊断和预防猪链球菌病方面奠定了基础。

猪链球菌；分离鉴定；PCR；药敏试验

猪链球菌病（S.suis）是由链球菌引起猪的一种急性、败血症型和脑膜炎型的人畜共患传染病[1]。现公认的血清型有35个，其分部有地域性，本病流行无明显季节性，但潮湿闷热的天气多发。

近几年随着集约化、规模化养猪业的发展，饲养密度的增加，常常导致猪链球菌病与猪瘟和猪圆环病毒病相混淆，应根据不同病的典型症状，结合分子生物学检测方法进行区分[2-6]。及早诊断，一旦发生本病往往给养殖户造成重大的经济损失。而该病的血清型比较复杂，根据临床症状和剖检变化很难做出诊断，而PCR方法可以直接检测疑似病猪的分离菌落，此方法比较准确、快速，但必须在一定的试验条件下才能完成[7]。猪链球菌病的病原中2型最为常见，报道也比较多，致病力最强，死亡率高，致病性主要为败血症和猪脑膜炎，病猪常突然死亡；人也可以感染致死。为了更好控制本病的发生，我们对某猪场疑似猪链球菌病进行了分离鉴定及药敏试验，以期为养猪场的疾病诊断和病原的净化提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验病料 2016年10月9日，在河南省新乡市辉县某大型种猪场发现15头疑似猪链球菌病的典型症状猪15头，其中1头已经死亡。病猪解剖后，按照无菌操作条件取患病猪的关节液、肺脏、心脏、脑及淋巴结等脏器组织。

1.1.2 主要试剂及培养基 M－肉汤培养基、营养琼脂培养基、鲜血培养基以及其他生化培养基均购于青岛高科技园海博生物技术有限公司；犊牛血清购于兰州生物制品研究所；细菌基因组DNA提取试剂盒，2×ES Taq MasterMix均购自天根生化科技有限公司；猪链球菌生化鉴定试剂和药敏片均购于保吉安集团公司。

1.1.3 引物设计与合成 根据GenBank已公布的猪链球cps1基因（登录号为NC：8877931.2）的高度保守核苷酸序列，利用Preimer 5.0软件，设计特异性引物1对（表1），引物由上海Sangon Biotech公司合成。上游引物序列为：5'－CATGGCCAGGGCCGTGGT GG－3'；下游引物序列为：5'－CGCCGCCGCGCCGATCA AAC－3'。并用DNAMAN软件进行基因同源性分析。

表1 本试验核酸扩增所用引物信息

1.1.4 试验动物 清洁级昆明种雌性小白鼠10只，均由华兰生物工程股份有限公司试验动物中心无偿馈赠。隔离饲养观察7 d后，根据试验要求进行分类，做动物接种试验。

1.2 方法

1.2.1 样本处理 对无菌采取的病料，依据猪的不同临床症状和剖检变化，采取相应的诊断方法，将处理过的组织和液体直接涂到载玻片上，并用生理盐水稀释，进行革兰氏染色，无菌采集急性死亡的病猪心血、肝、肺、脾及肠系膜淋巴结等组织，制作肝脏、脾脏的抹片，用关节液、心血涂片，干燥、火焰固定后进行革兰氏染色，在显微镜下检查其形态特征，可以作出初步的鉴定。

1.2.2 细菌分离培养 在超净工作台中，用接种环取肝、脓汁、脾及炎性分泌物等病料直接接种于鲜血琼脂平板上，放于37℃培养箱里24～48 h后，挑取单个菌落进行革兰氏染色，符合猪链球菌的形态和溶血特征后，再挑取典型菌落接种于琼脂斜面培养基、血清肉汤培养基和普通肉汤培养基，置于37℃培养24～48 h[7－9]。

PPP是广泛应用于基础设施、公用事业和自然资源开发等领域的项目融资模式，以合同方式确立，以利益共享、风险共担为原则，通过公共部门（政府）和私营部门（企业）共同努力，提升公共产品或服务的效率，实现物有所值。

1.2.3 生化试验 将致病菌株在培养基里进行纯培养后，接种于葡萄糖、山梨醇、乳糖、蔗糖、水杨苷、甘露醇、菊糖、棉籽糖、明胶、40%胆汁、肉汤、0.1%美蓝牛乳和马尿酸钠等生化培养基中。并将发酵管倒置于37℃温箱中培养，培养时间随试验的要求及细菌分解能力而定，可按各类细菌鉴定方法所规定的时间进行培养，观察结果[8]。

1.2.4 常规PCR检测 分别将invA的上、下游引物浓度稀释为20 mol/μL，各取0.3 μL，以分离纯化的猪链球菌用DNA提取试剂盒提取核酸，作为PCR的反应模版，其反应体系为20 μL：ddH2O 8.2 μL，上、下游引物cps1F、cps1R各0.4 μL，模板1 μL，2× ES Taq MasterMix 10 μL；PCR反应程序为：95℃预变性5 min；94℃变性40 s，59℃退火30 s，30个循环；72℃延伸1 min 40 s。经2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.2.5 动物接种试验 取处理好的病料加入等量佐剂后，用一次性注射器吸取（0.5 mL/只）给小鼠腹腔注射；同时，对照组按照同样的剂量注射生理盐水，观察其发病和死亡状况[9－14]。

1.2.6 药敏试验 根据美国临床国家实验室委员会执行的标准（NCCLS）进行，在超净工作台中，将分离到的猪链球菌纯化培养后，接种到200 mL的M－肉汤培养基中，37℃培养24 h后，计算其细菌的CFU；取调整好的菌液浓度500 μL滴加到20 cm的营养琼脂平板上，用酒精灯灭菌后的“T”型玻璃棒均匀涂布平板[15]。待平板中的液体稍干并完全吸收后，选取常用的11种抗生素类药物，无菌环境下，用消毒过的镊子夹取药敏片首先在贴于平板中央，之后用镊子轻轻按一下，每张药敏片间的距离不应少于20 mm。距平皿边缘不应少于17 mm，贴完后用封口膜缠住，放到37℃培养箱，20～24 h后，根据说明书上的要求进行判断，标准见表2。

表2 抗菌类药物的敏感性判定标准

2 结果

2.1 临床解剖检查

病猪多突然死亡，临床表现症状不明显，精神不振，呈稽留热，眼结膜潮红，有脓性的血样分泌物；耳尖、四肢、腹下出现紫红色出血斑；颌下淋巴结、咽、耳下、颈部等部位出现肿胀、硬固、热痛；部分仔猪有关节炎而出现运动障碍，后肢不能站立；个别猪突然发病，出现神经症状，死前有角弓反张的典型症状[16]。剖检后肺脏有大面积的出血、水肿，并有局灶性坏死结节，呈败血症的特殊症状；心脏外膜出血严重，有脑脊液；淋巴结肿大严重，内有深绿色黏稠的液体，关节腔内有黄色黏稠脓汁。

2.2 分离培养和鉴定

在鲜血琼脂平板上形成半透明、表面光滑湿润、稍微隆起的灰白色露滴样的小菌落；在普通琼脂平板上菌落贫瘠，较小，菌落周围可见约1 mm透明溶血环，呈典型的b型溶血。在血清肉汤培养基中形成均匀浑浊，试管底部有明显的沉淀，无菌膜。革兰氏染色为阳性球菌，有荚膜；在琼脂培养基中呈短链的圆形排列，在溶菌培养基中呈长链排列[17]。

不同的菌株理化特性存在着很大的差异，其结果见表3。

表3 分离株的疑似猪链球菌的生化试验鉴定结果

2.4 试验分离株PCR鉴定结果

PCR产物跑2%琼脂糖凝胶电泳显示，可扩增出1 157 bp大小的目的条带，其扩增大小与预期的片段相同，而阴性对照没有扩增条带。结果证明分离菌株为猪链球菌（图1）。

图1 疑似猪链球菌不同部位的病料和阴性样品PCR电泳

2.5 动物试验

免疫后5只小鼠分别呈现出了不同的症状，其中2只在接种后的2～3 d死亡；其余3只表现为呼吸困难、精神沉郁、颈部淋巴结肿胀、化脓。剖检见其肝、脾、肾肿大，膀胱充盈，胸腔内有渗出液，心外膜有出血点，用死亡后的小鼠脾脏，进行研磨并用生理盐水进行稀释，革兰氏染色为阳性，发现有大量单个、成对或呈短链状排列的阳性球菌。另外5只对照组没有任何的发病症状。

2.6 药敏试验

分离出的菌株致病性链球菌对11种抗菌药物敏感性情况见表4。

表4 致病性猪链球菌对11种抗生素药物的敏感性比较

由表4可得出这样的结果，所有抗生素中，致病性链球菌对泰乐菌素、丁胺卡那、头孢氨苄唑啉钠和环丙沙星高度敏感；对磺胺二甲氧嘧啶、磺胺六甲氧嘧啶有一定的耐药性；对青霉素、卡那霉素、强力霉素等抗生素药物为中度敏感。

3 结语与讨论

本研究把疑似猪链球菌的病猪解剖后，分别取不同的脏器和肠道组织，进行微生物学和PCR鉴定，根据分离菌株的形态染色特性、流行病学、剖检特征等可以初步作出判断，确诊还需要进行PCR鉴定和实验室诊断。药敏试验结果可知，该场的猪链球菌对常用的抗菌药物已经出现了不同程度的耐药性，而产生耐药的主要原因是养猪生产上滥用抗菌药物。尤其是一些家庭养殖户，缺乏药理知识，只要猪有病就用青霉素、卡那霉素、庆大霉素等，甚至盲目在饲料中添加抗生素药物，使原来的极少数耐药菌株得以大量生长繁殖和传代[18]。

近年的研究表明，磺胺类药物的耐药性机制主要有2个：一是染色体突变，在临床上常可见到DHFR结构基因突变引起对磺胺类耐药的菌株。二是质粒介导的耐药突变，获得了编码产生耐药性DHPS的质粒可导致对磺胺获得性耐药[12]。通过药敏试验结果可知，本场猪链菌球对磺胺类药物有耐药性。链球菌的致病力与荚膜、毒素和酶有关，该菌可产生许多毒素和酶，有溶血素、透明质酸酶、蛋白酶、链激酶、DNA酶[19]。对于患病的猪，应该早发现，早治疗，并根据不同的病型而采取相应的措施，特别是在用抗生素药物进行治疗时，应加大剂量或者联合用药，才能在一定时间内控制本病的发生。

猪链球菌病极易产生耐药性，建议采用药敏试验筛选出高敏感药物进行治疗，在一定程度上能迅速改善病情。当然在实际临床用药中也应考虑药物的成本和体内的吸收机理，综合选择最佳给药途径和方式[20]。另外，利用分离菌株制备组织苗是常规预防猪链球菌的一种切实可行的方法，保护率较高，免疫期长[21]。本次试验分离到的猪链球菌野毒株对抗生素药物耐药性严重，加强对养猪场的病原的分离与耐药情况进行检测，对养殖场和兽医工作者在预防及临床用药方面提供了一个有针对性、可靠的理论依据。

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（编辑：郭玉翠）

全球医疗不当问题严重

【路透社伦敦1月9日电】研究人员说，美国70%的子宫切除术、西班牙四分之一的膝关节置换手术和中国一半以上的抗生素处方，都属于不恰当的过度医疗。

在全球开展一系列研究的专家说，各地都同时存在过度医疗和医疗不足的情况，从而导致了一些可以避免的伤害和痛苦，还浪费了宝贵的资源。

这项由《柳叶刀》杂志和27位国际专家展开的研究还发现，剖腹产的比例在迅速增加—对一些女性来说其实并不需要—而用类固醇来防止早产的简单做法却落后了40年。

专家在一份声明中说：“不管是在富国还是穷国，一种常见的悲剧是使用昂贵且往往无效的技术，却忽视了廉价有效的干预手段。”

世界卫生组织估计，每年有620万例剖腹产是不必要的，其中50%发生在巴西和中国。

研究主要作者之一、美国波士顿劳恩研究所所长维卡斯·萨伊尼说，导致全球医疗不当的因素有“贪婪、利益冲突和信息缺乏”。这就共同造就了“一个不良医疗的生态系统”。

参与研究的香农·布朗利说：“病人和公民需要了解医疗体系无法解决这两个问题所带来的风险。在美国，我们浪费了本该用于改善国民健康的数十亿美元。”

研究分析了全球医疗过度和医疗不足的范围、成因和后果，发现这两个问题可以发生在同一个国家、同一个医疗机构甚至同一个病人身上。

研究人员说，中国的一项研究显示，57%的病人接受了不恰当的抗生素治疗；美国各州不恰当的子宫切除术比例在16%到70%之间；不恰当的膝盖置换术在西班牙和美国的比例分别是26%和34%。

他们还发现，不恰当的子宫切除术比例在台湾地区是20%，瑞士是13%。

研究人员说，医疗不足导致病人“容易遭受本可以避免的疾病和痛苦”；过度医疗则导致检查和治疗带来的本可避免的伤害，同时还浪费了原本可用在更需要的服务上的资源。

（转自参考消息[N]，2017-01-10）

Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test of Pathogenic Streptococcus Suis

LIU Zhike1,ZHANG Qiuyu2,CHEN Chuangfu1
(1.College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2.College of Animal Science and Technology,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

The experiment on a pig farm in Henan swine disease through clinical observation and pathologic examination for suspected streptococcal disease.Aseptic collected and sent to the laboratory for bacterial isolation,biochemical identification,Gram staining and animal pathogenicity test,and primers were designed according to cps1 gene of Streptococcus suis PCR reaction amplified bands,diagnosed with the disease.And the drug sensitivity test was performed on the isolated Streptococcus suis,the results showed that the strain of tylosin,amikacin,cefotaxime sodium and ammonia benzazoline ciprofloxac;penicillin,kanamycin,doxycycline, ampicillin,gentamicin and moderately sensitive;have a certain resistance to sulfonamides,two sulfamethoxydiazine sulfonamide six sulfamethoxydiazine.The study lays a foundation for diagnosis and prevention of Streptococcus suis disease farmers and veterinary workers.

Streptococcus suis;isolation and identification;PCR;drug sensitivity test

S858.285.1

A

1002-1957(2017)02-0105-04

2017-03-08

新疆重要人畜共患病分子疾病诊断机理研究（500003121002）作者简介：刘志科（1989-），男，河南新乡人，在读硕士研究生，主要从事人畜共患病研究工作.E-mail：624039729@qq.com

陈创夫（1962-），男，教授，博士生导师，博士，研究方向为分子病理学.E-mail：ccfxb@163.com