去氢甲睾酮单克隆抗体免疫亲和柱的制备与应用研究

马 力

·实验研究·

去氢甲睾酮单克隆抗体免疫亲和柱的制备与应用研究

马 力

目的 为了防止去氢甲睾酮(MA)滥用，对其残留进行监测，迫切需要一种有效、方便、快速的检测方法。方法 将MA单克隆抗体与CNBr-Sepharose 4B偶联制备获得去氢甲睾酮单克隆抗体免疫亲和柱(IAC)，同时对色谱分离条件进行优化、对IAC的性能及实际应用进行系统评价。结果 IAC对MA的最大柱容量是4.76 μg /g干胶，最佳上样和洗脱缓冲液分别为2%和70%的甲醇；柱子重复使用3次，柱容量和回收率分别为93.4%和81.1%。为进一步研究基质对提取效率的影响，用IAC对加标肉制品和中药材样品进行净化处理，其回收率为78.7%～95.1%。结论 试验制备了对MA具有特异性吸附的IAC，并对其用于中药材等实际样品进行净化处理的应用前景进行了评价。

去氢甲睾酮；单克隆抗体；免疫亲和柱；ELISA

去氢甲睾酮(1-dehydro-17a-methyltesto- sterone，MA)，是一种人工合成的甾类雄性蛋白同化激素，具有增加蛋白质合成、促进肌肉增长和提高中药材转化率等作用，因而MA作为生长促进剂在畜牧养殖生产中广泛应用[1]。但是，消费者长期摄入含有此类激素类药物的动物源性食品会导致肝功能损害、生育能力降低、高血压、动脉粥样硬化及精神和行为障碍等[2-4]。因此，世界上很多国家对MA在畜牧业上的应用都有严格限制。为了防止MA滥用，我院2012年6月-2015年9月对其残留进行监测，迫切需要一种有效、方便、快速的检测方法。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂:猪肉样品购自当地超市，中药材粉末样品本院药剂科提供；MA、群勃龙(TR)、丙酸睾酮(TP)、HRP标记的羊抗鼠IgG为Sigma公司产品；CNBr-Sepharose 4B购自GE-Healthcare公司；高效液相色谱级甲醇购自Fisher Scientific公司，其余试剂均为分析纯购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器设备:Synergy HT多功能酶标检测仪(Bio-TEK instruments公司)；Cary 100紫外光谱仪(Varian Medical Systems公司)；小型垂直电泳槽(Bio- Rad Laboratories公司)；5415R离心机(德国Eppendorf公司)；超纯水系统(成都超纯科技有限公司)。

1.3 MA单克隆抗体的纯化:以实验室之前获得的杂交瘤细胞(稳定分泌去氢甲睾酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D6F10B4，江苏大学食品营养与安全实验室惠赠)进行克隆和扩大培养、制备腹水单抗。单抗纯化采用使用正辛酸—饱和硫酸铵法，并用SDS-PAGE对纯化后的单抗进行纯度评价。利用紫外分光光度法测定纯化后的MA单抗在280 nm和260 nm处的吸光度，其浓度(mg/mL)=1.45A280 nm- 0.74A260 nm计算。

1.4 凝胶电泳:纯化抗体在12%聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色。

1.5 IAC的制备:参照CNBr-Sepharose 4B的产品说明书并略作修改，具体步骤如下：将纯化后的单抗对pH 8.3、0.1 mol/L NaHCO3(含0.5 mol/L NaCl)的偶联缓冲液透析过夜，并稀释到一定浓度备用。准确称取CNBr-Sepharose 4B干胶0.05 g，于5 mL 1 mmol/L HCl溶液中充分溶胀。用10倍体积以上的偶联缓冲液快速洗涤，4 000 r/min离心1 min，2次离心； 取洗涤后的1 mL湿胶，迅速加入2 mL一定浓度的抗体溶液，于室温下振荡反应；反应结束后，用10倍体积以上的偶联缓冲液洗涤除去未偶联的抗体，收集洗涤液，计算偶联率；加入5倍体积的pH 8.0、0.1 mol/L Tris-HCl(含0.5 mol/L NaCl)，室温下振荡封闭2 h；先后用5倍体积pH 4.0 的0.1 mol/L 醋酸盐缓冲液(含0.5 mol/L NaCl)、pH 8.0的0.1 mol/L Tris-HCl(含0.5 mol/L NaCl)交替洗涤3次，然后用pH 7.4的0.01 mol/L PBS 洗涤2次，进行装柱。

1.6 IAC提取条件优化:为了提高IAC提取效率，其上样和洗脱缓冲液的优化参照文献进行[5]。将500 ng的MA分别溶解在2%、5%或10%的甲醇/水(v/v)溶液中，上样，充分冲洗后除去非特异性结合的MA。然后用5 mL洗脱缓冲液(60%、70%、80%、90%、100%甲醇-水溶液)进行洗脱，收集冲洗和洗脱组分，用ELISA方法检测MA量。一抗是文中1.3制备的单抗，二抗是HRP标记的羊抗鼠IgG为Sigma公司产品，方法参照文献成熟方法技术。

1.7 柱容量测定:IAC的柱容量测定参照文献[6]。在最佳提取条件下，将2 mg MA溶解在10 mL 2%的甲醇溶液中，连续上样液(1.0 mL/次)，利用固定相的结合特性来吸附目标产物，达到分离纯化的液相色谱方法测定穿过组分中MA的含量并计算最大柱容量。

1.8 基质对 IAC净化效果的影响:为了研究基质对IAC净化效果的影响，猪肉和中药材样品中分别添加1.2 ng/g和4.8 ng/g水平的MA。将5 g猪肉样品进行匀浆，并在20 mL叔丁基甲基醚中振荡5 min[7]，超声提取10 min，8 000 r/min离心10 min，收集上清液，并用叔丁基甲基醚重复萃取2次，合并萃取液，旋干。将残余物溶解在3 mL 2%甲醇中，上样，收集洗脱液测定MA的含量，并计算IAC净化的回收率。中药材粉末样品的处理步骤与猪肉样品相似，用50%的乙醇/水(v/v)代替叔丁基甲基醚。

2 结果

2.1 MA单克隆抗体的纯化和表征:由于(NH4)2SO4沉淀法简便且抗体损失量较小，在本实验中用来纯化MA抗体。通过测定280 nm和260 nm处的吸光度，纯化后的单克隆抗体浓度为3.4 mg/mL。SDS-PAGE分析表明抗体已被有效纯化(图1)。

2.2 IAC色谱条件的优化:上样和洗脱条件决定了分析物(抗原)—抗体的结合和分离状态以及抗体的活性，因而在很大程度上影响着IAC净化处理效率。本试验中选用3种不同的上样缓冲液(2%、5%和10%的甲醇)，结果表明甲醇浓度对结合率没有显著影响(97.2%、100.3%和95.4%)，因此，选择低浓度2%的甲醇作为上样缓冲液。

图1 纯化后MA单抗的SDS-PAGE

不同洗脱缓冲液(60%、70%、80%和90%的甲醇/水溶液)的解吸能力如图2所示，随着甲醇浓度由60%到90%，MA的洗脱量也由74.4%提高到91.1%。根据蛋 白质 中组氨酸、色氨酸或半胱氨酸等，氨基酸残基与色谱柱上的金属离子螯合作用形成络合物，从而实现分离蛋白质的目的。

图2 不同甲醇体积分数下洗脱组分中MA的含量

虽然甲醇浓度越高，解吸效率越高，但是对抗体的损害也越大。因此，选择70%的甲醇作为洗脱液，柱中80%以上的MA可以被洗脱。

2.3 IAC的特性:在最佳提取条件下，对IAC的最大柱容量及柱之间的变异性和重复使用性进行了评价。将10 mL 200 ng/mL的MA溶液连续上样过柱，每1 mL收集1管，测定MA含量。前5 mL穿过液中几乎检测不到MA，上样第6 mL时，穿过液中检测到10 ng MA。因此，计算得该IAC柱的最大柱容量为4.76 μg MA/g干胶，见表1。

随机取6个IAC柱，分别用含50 ng、250 ng和500 ng的MA溶液上样，收集洗脱组分测定MA含量并计算回收率。结果显示，MA回收率在76%～97%，柱与柱之间的相对标准偏差(RSD)为8.5%，表明所制备IAC具有较好的重现性。

连续上样，收集洗脱组分，测定回收率。如图3、图4所示，经过3次使用后，IAC柱仍有93.4%的柱容量和81.1%的回收率，表明所制备IAC具有较好的稳定性。

表1 MA的IAC柱之间的重复性

图3 IAC柱容量测定

图4 重复使用后IAC柱容量和回收率变化曲线

2.4 基质对IAC净化效率的影响:FAO/WHO[7]规定的MA结构类似物TR最大残留量为2.0 ng/g，因此设定1.2 ng/g和4.8 ng/g 2个水平的加标量，进行实际样品的加标回收实验，样品中MA回收率为78.7%～95.1%。结果表明，所制备IAC能够有效用于动物组织和中药材样品的净化处理，见表2。

表2 IAC净化处理食品和中药材样品中MA的回收率(n=3)

3 讨论

目前，食品或中药材中MA残留检测常用气相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法等仪器分析方法。这些方法虽然结果准确，但是由于目标分析物量级小且样品基质复杂，在仪器分析前要对样品进行大量的预处理。传统的样品前处理方法如索氏提取、液液分配和固相萃取等，其敏感性和再现性较差，所用试剂量较大，操作费时。而免疫亲和色谱(IAC)方法是以抗体和抗原之间的特异性和可逆结合为原理对目标物质进行分离，是一种强有力的分离技术[7-8]。由于其特异性高、操作简单，IAC被广泛应用在真菌毒素、兽药、农药和重金属残留量检测的样品前处理。我们实验室已成功制备了MA多克隆抗体IAC柱，但与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更好的均一性、重复性。本试验制备了对MA具有特异性吸附的IAC，并对其用于食品或中药材等实际样品进行净化处理的应用前景进行了评价。

综上所述，本实验成功制备获得了去氢甲睾酮单克隆抗体免疫亲和柱，优化建立了免疫亲和净化处理条件，并对IAC的性能和实际应用进行了评价。结果表明，IAC净化处理的上样和洗脱条件分别为2%和70%甲醇溶液，IAC的柱容量为4.76 μg MA/g干胶；柱和柱之间的变异系数不高于8.5%，重复使用3次后，IAC的柱容量和回收率仍高于93.4%和81.1%；使用IAC对食品和中药材粉末样品中MA进行净化处理，回收率为77.7%～95.1%。

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Preparation and application research of immunoaffinity column for the selective extraction of metandienone

MALi.

NingxiaResearchInstituteofTraditionalChineseMedical,Yinchuan750021,China

Objective To prevent the abuse of MA,an effective and convenient method was used to detect the residue.Methods Immunoaffinity column(IAC)was prepared by coupling CNBr-activated Sepharose with the metandienone monoclonal antibody(mAb)2% methanol and 70% methanol were selected respectively as loading and eluting solution by optimization.The maximum binding capacity of the column for MA reached 4.76 μg/g gel.After three times of usage,the binding capacity and recovery still remained 93.4% and 81.1% respectively.Results To further verify the effect of matrices on the extraction efficiency,the IAC was challenged with MA-fortified meat and herbal medicines and the recovery rate were found to be in the range of 78.7%～95.1%.Conclusion IAC with specific absorption of MA is prepared and the application prospect of the purification treatment was evaluated.

Metandienone;Monoclonalantibody；IAC；ELISA

10.13621/j.1001-5949.2017.04.0334

宁夏中医研究院，宁夏 银川 750021

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170328.2214.022.html

R 927.2

A

2016-11-11 [责任编辑]马兴忠