体外培养角膜缘干细胞重建眼表的实验研究

詹冬梅，杨红燕，哈玲芳，韩树梅

·论 著·

体外培养角膜缘干细胞重建眼表的实验研究

詹冬梅，杨红燕，哈玲芳，韩树梅

目的 探讨以去上皮羊膜为载体体外培养的角膜缘干细胞移植片治疗碱烧伤兔动物模型的效果。方法 应用印迹细胞学方法选取完全性角膜缘干细胞缺陷的兔眼碱烧伤模型，另眼取材通过组织块联合酶消化法对角膜缘干细胞进行体外培养，鼠单克隆抗体AE5对其进行免疫细胞化学染色鉴定。对碱烧伤兔眼行植片移植，观察术后眼表状态变化。结果 体外培养的兔角膜缘细胞在去上皮羊膜上生长良好，形成复层，AE5细胞免疫鉴定呈强阳性。不同移植片治疗碱烧伤兔眼，以去上皮羊膜为载体体外培养的角膜缘干细胞自体移植组和同种异体移植组，术后角膜病变总评分与去上皮羊膜移植组和对照组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 以去上皮羊膜为载体体外培养的角膜缘干细胞自体移植与同种异体移植在兔眼碱烧伤模型的眼表重建方面均显示出良好的效果。

角膜缘干细胞；碱烧伤；印迹细胞学；细胞培养；去上皮羊膜

角膜上皮在维持角膜透明性方面起非常重要的作用，其更新及创伤愈合的过程已被研究证实需要依靠角膜缘干细胞的增殖、分化和移行[1]。眼部酸、碱烧伤或热烧伤、手术创伤和药物毒性等多种原因，均可能导致角膜缘干细受损、坏死乃至功能衰竭，严重者可致视力丧失。角膜缘干细胞缺陷所致眼表疾病已成为角膜病致盲的重要原因之一[2-3]，针对此类疾病理想的治疗途径就是进行角膜缘干细胞移植。本研究将体外培养的角膜缘干细胞借助去上皮羊膜载体移植至碱烧伤兔动物模型眼表，观察术后受体眼表状态变化，评估角膜缘干细胞体外培养后移植重建眼表的可行性和有效性。

1 材料与方法

1.1 实验动物：健康清洁级新西兰大白兔若干只，体重2～2.5 kg，限雄性，眼前节应用裂隙灯检查未发现疾患。

1.2 实验方法

1.2.1 眼表碱烧伤兔动物模型的建立：实验兔右眼用于制作完全性角膜缘干细胞缺陷眼表碱烧伤模型。3%戊巴比妥钠注射液(1 mL/kg)耳缘静脉麻醉，盐酸奥布卡因滴眼液(倍诺喜，ALCON公司)表面麻醉，开睑器开睑，无菌状态下沿角膜缘环形剪开结膜，后退3 mm，将浸透在1 mol/L氢氧化钠溶液的滤纸环片(内径9 mm，外径16 mm)置于兔角膜缘30 s后取出，大量生理盐水冲洗结膜囊5 min，定期观察记录眼表情况。1个月后参照潘志强等制定的角膜病变评分标准[3]，选取角膜上皮部分或全部剥脱、角膜混浊≥2分，角膜新生血管评分≥3分的实验兔，完善角膜印迹细胞学检查。

1.2.2 实验分组：通过印迹细胞学证实角膜缘干细胞失代偿的碱烧伤模型成功的实验兔32只，随机分为单纯对照组(A组)、去上皮羊膜移植组(B组)、以去上皮羊膜为载体体外培养的角膜缘干细胞自体移植组(C组)、以去上皮羊膜为载体体外培养的角膜缘干细胞同种异体移植组(D组)，每组各8只。

1.2.3 制备去上皮人羊膜载体:选择宁夏医科大学总医院妇产科健康剖宫产妇(签署知情同意书)胎盘，无菌条件下仔细剥离羊膜并用大量含有青链霉素的PBS液反复冲洗后，上皮面朝上贴附在无菌硝酸纤维膜上，修剪成4.5 cm×4.5 cm大小，置于事先消毒好备用的100%甘油瓶中脱水，24 h后在无菌条件下重新置换至新的含有甘油与DMEM/F12培养基(1∶1)的无菌瓶里密封，-20 ℃冰箱冷冻保存。应用前复苏解冻，PBS液冲洗干净后将羊膜放于含有20%胎牛血清的培养液中复水30 min备用。使用前需检测羊膜无菌，无菌条件下，在培养皿中加入2 mL用胰蛋白酶置于37 ℃、5% CO2培养箱中热消化30 min；玻璃弯匙轻轻刮除羊膜上皮细胞，PBS液清洗羊膜后将羊膜去上皮面向上，平铺于33 mm培养皿中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中24 h待用。

1.2.4 兔角膜缘组织取材、体外培养及鉴定

1.2.4.1 兔角膜缘组织取材：对右眼造模成功的实验兔进行左眼角膜缘干细胞取材。全麻后无菌条件下左眼置入开睑器，以穹窿部为基底“L”形剪开上方球结膜，显微镜下板层刀于角膜缘处楔形切取一浅层角膜缘灰白色交界区组织(约1 mm×3 mm×2 mm)，放入装有PBS液的EP管中保存。

1.2.4.2 兔角膜缘干细胞原代培养：采用组织块联合胰蛋白酶消化法进行角膜缘干细胞原代培养。在超净台里，应用PBS液漂洗组织块多次后放入离心管，加入用量为组织块30倍的含有0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的混合消化液进行热消化37 ℃ 10 min，见有大量圆形细胞脱落时，加入PBS液及含有20%胎牛血清的培养液以终止EDTA和胰蛋白酶的消化作用；离心后弃上清液，加入2 mL内含20%胎牛血清的培养液吹打混匀后收集细胞悬液放入无菌培养瓶内，连同组织块置于培养箱共同培育，于第7天去除组织块，倒置显微镜观察细胞生长情况。

1.2.4.3 兔角膜缘干细胞传代培养：吸出培养瓶里的细胞培养液，转入离心管中吹打、洗涤、离心后加入含有20%胎牛血清的细胞培养液适量，配制成细胞密度为2×104个/mL的单细胞悬液，根据用途需要分别接种。对培养至特定时间(7 d、14 d和21 d)需要进行鼠单克隆抗体AE5免疫细胞化学染色鉴定及观察细胞形态学，在配置成单细胞悬液后接种至12孔细胞培养板，待细胞爬片后分别进行鉴定及HE染色；部分单细胞悬液接种至事先铺有已处理好的去上皮羊膜的培养板中进行培养；倒置显微镜观察细胞贴壁及生长情况，用于角膜缘干细胞移植片的制作。

1.2.4.4 角膜缘干细胞鉴定及形态学观察：将传代培养至7 d、14 d和21 d的兔角膜缘干细胞，配制成单细胞悬液，依此接种于细胞培养板中继续培养、观察，待细胞贴壁后分别行鼠单克隆抗体AE5细胞免疫化学鉴定及HE染色，光镜下观察、采图。

1.2.5 移植重建眼表

1.2.5.1 手术步骤：造模后1个月，将实验兔全麻后固定，盐酸奥布卡因滴眼液点右眼，常规消毒、铺巾，置开睑器，沿碱烧伤兔眼角膜缘剪开结膜，暴露角膜缘后4 mm范围的巩膜，板层切除角膜表面病变组织，包括全周角膜缘的血管翳。A组仅处理眼表病变，B组、C组、D组行移植片移植(B组为去上皮羊膜移植片；C组为体外培养的自体角膜缘干细胞的去上皮羊膜植片；D组为体外培养的同种异体角膜缘干细胞去上皮羊膜植片)。将略大于角膜植床的移植片，上皮面朝上置于右眼相应位置，8-0可吸收缝线将其间断缝合固定于浅层巩膜并平整紧密贴覆于植床上；将游离的结膜覆盖于外周部分的羊膜上，8-0可吸收缝线间断缝合固定，术眼涂氧氟沙星眼膏后4-0丝线缝合睑裂。

1.2.5.2 术后处理和观察：术后1周拆除睑裂缝线，术后2周、1个月、3个月，裂隙灯观察、记录兔术眼眼表情况并根据表1评分。

2 结果

2.1 成功建立眼表碱烧伤动物模型:碱烧伤兔眼表角膜印迹细胞学检查可见，角膜缘及角膜缘上、下、内、外可见大量PAS染色阳性的结膜杯状细胞，角膜上皮细胞散在，表明角膜上皮已经结膜化(图1，目录后)。

2.2 兔角膜缘干细胞的原代和传代培养:原代培养接种初期，显微镜下可见散在单个细胞，胞浆丰满透明，呈悬浮状态；培养24～72 h，细胞从组织块爬出，散在或簇样分布，逐渐形成“沙滩样”匍行带；3～5 d后，细胞生长形成生长晕；7～9 d后，生长达高峰，达到70%～80%的汇合状态，此时取出组织块；第10～13天后，细胞形态以多边形和梭形为主，细胞基本汇合形成单层，铺满整个培养壁，见图2(目录后)。消化传代的角膜缘干细胞接种24 h后大部分细胞即贴附于去上皮羊膜表面，2 d后成片生长，以多边形和梭形为主要细胞形态，约7 d左右形成细胞单层，几天后细胞呈排列致密的复层结构覆盖整个去上皮羊膜(图3，目录后)。

2.3 角膜缘干细胞形态学及鉴定:光镜下的角膜缘干细胞多呈卵圆形或多角形，HE染色见图3；对培养的兔角膜缘干细胞进行鼠单克隆抗体AE5免疫细胞化学染色鉴定呈现阳性反应，见图4(目录后)。

2.4 裂隙灯检查结果:兔眼表碱烧伤1个月后，角膜混浊、瘢痕形成，瞳孔区角膜薄变，角膜周边可见新生血管，表面结膜化；A组术后角膜水肿雾浊、表面粗糙；术后2周～3个月角膜周边新生血管快速长入，覆盖整个角膜，角膜上皮结膜化，眼内结构窥不清。B组、C组、D组术后当天可见瞳孔区角膜清，周边浅层角膜混浊，植片在位；术后第1周，B组、C组、D组拆除睑裂缝线后可睁眼，眼球运动不受限，植片在位、光滑无感染；B组角膜混浊，但前房及瞳孔隐见；C组、D组角膜中央清，周边轻度雾浊水肿，前房及瞳孔隐见。术后第2周，B组植片在位、部分溶解，角膜表面仍混浊发白、粗糙，前房及瞳孔隐见，边缘有新生血管生长；C组、D组角膜缘区植片溶解，角膜雾浊、表面较粗糙，角膜边缘未见新生血管。术后1个月，B组植片溶解，角膜中央渐清，周边混浊，荧光素染色显示角膜上皮部分缺损，有新生血管向角膜长入，但未达瞳孔区；C组、D组植片大面积溶解，角膜中央清，周边混浊，荧光素染色显示角膜上皮点片状缺损，部分区域角膜可见少许新生血管从周边长入。术后3个月，B组角膜透明度有所增加，荧光素染色可见部分着色，周边新生血管长入，部分区域角膜缘结膜化；C组、D组角膜上皮层基本完整，角膜透明度明显增加，荧光素染色未见明显着色，部分周边角膜可见少量新生血管，未见结膜上皮化。

2.5 各组角膜混浊指数评分、角膜新生血管指数评分及角膜上皮荧光素染色指数评分结果:见表1。

表1 各组角膜混浊、新生血管及荧光素染色评分结果

2.6 各组角膜病变总评分(角膜混浊指数评分、角膜新生血管指数评分及角膜上皮荧光素染色指数评分之和)比较：B组、C组、D组角膜病变总评分均低于A组，差异有统计学意义；C组、D组角膜病变总评分低于B组，差异有统计学意义；C组角膜病变总评分与D组比较差异无统计学意义，见表2。

表2 各组术后角膜病变总评分比较(分，±s)

注：*与A组比较，P<0.05；#与B组比较,P<0.05。

3 讨论

眼部碱烧伤是临床上最常见的、具有代表性的一种眼部化学伤，可造成角膜缘干细胞缺乏，角膜上皮再生功能和屏障功能障碍，表现为角膜慢性炎症、上皮持续缺损、角膜结膜化、新生血管形成、结膜囊狭窄、角膜混浊，甚至失明[2-4]。此类患者常需要通过角膜移植复明，但对此类以角膜缘干细胞功能障碍为特征的角膜疾病，传统的穿透性角膜移植术或者板层角膜移植术虽可重建眼表，却不能阻止角膜缘干细胞功能衰竭，移植片上的上皮细胞因得不到角膜缘干细胞不断分裂增殖短暂扩充细胞TAC的补充,植片本身TAC耗竭可导致透明植片往往在移植术后6个月后混浊、血管化[5]。因此，国内外研究[3，6-7]认为只有采用角膜缘干细胞移植重建角膜缘功能才是治疗此类疾患必要而有效的手段。

体外培养角膜缘干细胞首要条件是准确获得培养用的角膜缘组织。角膜缘处主要由角膜基质层及上皮层组成，共聚焦显微镜下在基底部可以发现特殊的乳头状结构，称为“VOGT栅栏”，就是角膜缘干细胞所在部位[1，2-5]。Li DQ等[8-9]发现了角膜上皮低分化细胞干细胞存在于角膜缘基底部的上皮内。本研究在显微镜下取出一块约1 mm×3 mm×2 mm大小的角膜缘组织及完整的上皮基底层，根本不会影响眼部健康，且通过体外培养出的角膜缘干细胞足以供移植使用，这为角膜缘干细胞功能障碍患者的眼表重建提供可能。

角膜缘干细胞体外培养的理想载体应当是既能替代缺损的浅层角膜基质，解决细胞黏附问题，又能改善细胞所需的生长微环境。Kim HS等[10]在眼表化学烧伤模型的角膜表面进行羊膜移植取得成功后，羊膜被广泛应用于眼科领域。羊膜可分泌多种细胞因子，并带有活性细胞，是一种很好的细胞培养载体。有文献报道[11-13]将羊膜的上皮细胞消化刮除，可以提高种植细胞的成活率，便于为接种的角膜缘干细胞提供理想细胞基质。本实验采用去上皮羊膜作为角膜缘干细胞的培养载体，发现接种于去上皮羊膜上的干细胞宜贴壁，成膜时间短，生长速度快。

对碱烧伤兔眼分组进行不同的移植片移植，通过对术后角膜混浊程度、角膜新生血管生长及角膜荧光素染色情况等眼表状态进行评分发现，与单纯对照组和去上皮羊膜移植组相比，以去上皮羊膜为载体体外培养的角膜缘干细胞自体移植和同种异体移植可显著减轻角膜病变，恢复角膜上皮的完整性，减少新生血管形成，增加角膜透明性，在角膜病变修复及眼表重建方面均显示出较好效果。国外学者发现[14]，角膜缘HLA-DR抗原主要存在于Langerhans细胞表面，体外培养环境下，Langerhans细胞数量会随培养时间延长而减少，其表面DR抗原也会逐渐下降。魏彤心等[15]应用HLA-DR抗原的单克隆抗体对培养的人角膜缘干细胞进行检测时也发现，在体外培养细胞中未见HLA-DR抗原阳性细胞存在。本研究也显示，以去上皮羊膜为载体体外培养的角膜缘干细胞自体移植组与同种异体移植组的角膜病变总评分比较差异无统计学意义，因此推测，角膜缘干细胞经过体外培养后可能丧失了部分免疫性，其抗原性有所降低。虽然自体角膜缘干细胞体外培养后可有效扩充细胞数量且可避免异体间的排斥反应，但对双眼患者仍不适用。同种异体角膜缘干细胞由于来源更为广泛，经过体外培养后可大大降低其抗原性，我们可以充分利用这一点，对自体移植取材困难的双眼患者可进行同种异体取材进行体外培养后移植，希望为临床上解决因角膜缘干细胞功能障碍所致的眼表疾病提供新的治疗思路，也为同种异体角膜缘干细胞移植临床开展提供客观的实验依据。

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Experimental study on reconstruction of ocular surface with transplantation of corneal limbus stem cells in vitro for the treatment of alkali burn of animals

ZHANDongmei,YANGHongyan,HALingfang，HANShumei.

DepartmentofOphthalmology，TheGeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004,China

Objective To study the transplantation about denuded amniotic membrane as the carrier of allogeneic corneal limbus stem cell for the treatment of the rabbit models of alkali burn.Methods Using the impression cytology to select the completeness of limbal stem cells dysfunction from the rabbit models of alkali burn(the right eyes).The tissue block were got in the left eyes and used the enzyme digestion method to culture the corneal limbus stem cells in vitro and identify them through the mouse monoclonal antibody AE5 immunocytochemistry staining.Then the transplantation were performed for the treatment of animal models of alkali burn.Results The cultivated limbal corneal epithelial cell on the amniotic membrane grew well and formed stratified layers.AE5 cellular immune identification was strong positive.Compared the denuded amniotic membrane transplantation group and the control group，there were statistically differences in denuded amniotic membrane as the carrier to epithelium in vitro cultured autologous and in vitro cultured allogeneic corneal limbus stem cell transplantation group respectively after surgery(P<0.05).Conclusion Combining the trypsin digestion cell suspension and tissue explant culture method can produce stem cells of limbus of cornea.The mouse monoclonal antibody AE5 resistance can be used to identify the corneal limbus stem cells.As the carrier,the denuded amniotic membrane epithelium with autologous culture in corneal limbus stem cell transplantation and allogeneic culture are all showed the same good effect in rabbit model of alkali burn in ocular surface reconstruction.

Corneallimbusstemcells；Alkaliburn；Impressioncytology；Cellculture；Denudedamnioticmembrane

10.13621/j.1001-5949.2017.04.0291

宁夏科技支撑计划项目(2013ZYS102)；宁夏医科大学科学研究基金资助重点项目(XZ201410)

宁夏医科大学总医院眼科，宁夏 银川 750004

詹冬梅(1970-)，女，硕士学位，主任医师，从事眼科学临床、科研及教学工作。

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170328.2051.002.html

R779.65

A

2016-06-19 [责任编辑]李 洁