转移抑制基因1和微血管密度在胆囊癌中的表达及其临床意义*

陈义钢，顾琛，周宏，姚路斌，夏加增，瞿甦

（南京医科大学附属无锡第二医院，江苏 无锡 214002）

转移抑制基因1和微血管密度在胆囊癌中的表达及其临床意义*

陈义钢，顾琛，周宏，姚路斌，夏加增，瞿甦

（南京医科大学附属无锡第二医院，江苏 无锡 214002）

目的 研究转移抑制基因1（MTSS1）和微血管密度在胆囊癌中的表达，分析MTSS1和微血管密度与胆囊癌临床病理参数及预后的关系。方法利用该院已构建成功的胆囊癌组织芯片，通过免疫组织化学方法检测MTSS1和微血管密度在胆囊癌组织中的表达，分析MTSS1和微血管密度与胆囊癌病理参数的关系。随防并收集患者的预后资料，通过单因素和多因素生存分析评估MTSS1和微血管密度与胆囊癌患者预后的关系。结果MTSS1在胆囊癌组织中的阳性表达率为44.1%（52/118）；微血管密度在胆囊癌组织中为（52.80±1.94），在正常胆囊组织中为（29.33±2.97）。低表达的MTSS1和胆囊癌的TNM分期、淋巴结转移、分化程度密切相关（P＜0.05），高微血管密度和肿瘤的TNM分期及肝转移有关。MTSS1的表达与微血管密度负相关。Kaplan-Meier和Cox生存分析表明：MTSS1和微血管密度与胆囊癌患者的总生存率相关，是胆囊癌的独立预后因素。结论MTSS1蛋白广泛表达于正常胆囊组织，而在癌组织中的表达率降低。低表达的MTSS1、高的微血管密度和胆囊癌的恶性生物行为有关，它们是有效的胆囊癌预后指标。MTSS1有抑制胆囊癌进展的作用，其抑癌作用可能与影响肿瘤微血管密度有关。但其具体功能机制尚有待于进一步研究。

胆囊癌；肿瘤转移；转移抑制基因；微血管密度

胆囊癌是预后较差的恶性肿瘤之一，早期易发生转移，一旦发现多为晚期，目前这种恶性肿瘤的分子生物学机制还不完全为人们所知[1]。转移抑制基因1（metastasis suppressor 1，MTSS1）参与调控多种肿瘤的浸润与转移等恶性行为，在膀胱癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌等癌组织中低表达[2-4]，但它在胆囊癌中和表达及其临床意义还少见报导。微血管密度（microvessel density）也对肿瘤的发生、发展和转移起着重要作用[5-6]。本研究将检测胆囊癌组织中MTSS1的表达和计数微血管密度，分析它们与胆囊癌重要临床参数及预后的关系，并探讨MTSS1和微血管密度两者之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 组织标本

本实验所用的组织芯片为南京医科大学附属无锡第二医院普外科构建与保存。该组织芯片含有118例胆囊癌患者的标本。实验组男性患者42例，女性患者76例；中位数年龄63.7岁。具有完整的随访资料的患者有76例，随访时间最长67个月，最短1个月，中位时间18.3个月。另随机选择同期手术切除并经病理证实的正常胆囊组织为对照组，对照组20例，男性8例，女性12例；中位数年龄54.5岁。其中3例来自肝破裂患者，17例来自肝癌患者摘除未被侵犯的胆囊。

1.2 免疫组织化学法

1.2.1 抗体来源 MTSS1（稀释比例1∶50；Caltag-Medsystems，英国）和CD34（稀释比例1∶100；Dako Cytomation，丹麦）。免疫组织化学技术采用SP法（福州迈新公司），磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）替代一抗作阴性对照组。

1.2.2 结果判定 免疫组织化学结果由2位病理科医师独立阅片。MTSS1阳性染色为淡黄色、棕黄色或棕褐色，定位于细胞浆和/或细胞膜。采用2级计分法，阳性细胞计数：根据阳性细胞占＞5个高倍镜视野比例计数，分为两类：0%～30%为1分；＞30%为2分。染色强度分类：淡黄色1分；黄或深黄色为2分；褐或棕褐色为3分。两类计分相乘＞1为阳性。

CD34免疫组织化学染色用来评估胆囊癌组织中微血管密度，染色为棕黄色的，并可与周围结缔组织、肿瘤细胞区分开来的管状结构为单一的、可计数的微血管。首先在低倍镜下选择热点（微血管密度高的区域），然后选择3个热点区域，在光学显微镜下计数微血管数量，取其平均值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件进行数据分析。计数资料如基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算，各组间基因型及等位基因频率比较采用四格表χ2检验。计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组间数据的比较依据资料的性质，采用t检验或方差分析。组间变量相关性分析用 Pearson或Spearman法处理；单因素生存曲线用Kaplan-Meier；多因素生存分析用Cox模型分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTSS1和微血管密度在胆囊癌中的表达

MTSS1主要表达于细胞浆，强阳性，正常胆囊黏膜不着色或呈弱阳性。MTSS1在胆囊癌组织中的阳性表达率为44.1%（52/118）；在正常胆囊组织中阳性表达为85%（17/20）（见图1），两者相比差异有统计学意义（P=0.001）。微血管密度在胆囊癌组织中为（52.80±1.94），中位数为51.13；微血管密度在正常胆囊组织中为（29.33±2.97）（见图2），两者相比差异有统计学意义（P=0.013）。

2.2 MTSS1及微血管密度在胆囊癌中的表达与临床病理参数之间的关系

MTSS1的阳性表达与有无淋巴结转移、肿瘤的不同分化程度及TNM分期相关，高微血管密度和肿瘤的不同TNM分期及有无肝转移相关。见表1。

2.3 MTSS1的表达与微血管密度的相关性

为了便于统计MTSS1与微血管密度之间的相关性，本研究将微血管密度＞51.13（中位数）的标本称为高微血管密度，密度＜51.13的标本称为低微血管密度。Spearman相关性检验显示，MTSS1的表达与微血管密度之间负相关，差异有统计学意义（r=-0.555，P=0.000）。见表2。

图1 MTSS1在正常胆囊与胆囊癌组织中的表达 （×200）

图2 在胆囊癌与正常胆囊组织中的微血管密度 （×200）

表1 MTSS1及微血管密度与胆囊癌患者临床病理参数的关系

2.4 MTSS1的表达和微血管密度与患者生存期的关系

纳入随防研究的患者有72例。其中男性27例（37.5%），女性45例（62.5%）。胆囊癌切除术患者的中位生存时间为7.35个月。MTSS1阳性表达患者中位无瘤生存时间为37.5个月，MTSS1阴性表达患者为5.6个月，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。Kaplan-Meier分析提示，MTSS1的表达和微血管密度与患者总生存率有相关性（P＜0.05）（见图3、4）。Cox回归分析表明，肝转移、MTSS1低表达和高微血管密度是胆囊癌的独立预后因素（见表3）。

表2 MTSS1与微血管密度之间的相关性

图3 Kaplan-Meier生存曲线提示MTSS1表达与胆囊癌预后相关

图4 Kaplan-Meier生存曲线提示微血管密度与胆囊癌预后相关

表3 影响胆囊癌预后的Cox多因素回归

3 讨论

目前认为肿瘤的发生与发展是涉及到多个基因、多种因素的综合病理过程。细胞外微环境的改变、细胞内重要结构（如细胞骨架）的功能异常都是影响肿瘤发展、转移的重要因素。LEE等[7]在研究膀胱癌转移机制的实验中发现一个新的肿瘤转移抑制基因MTSS1。该研究发现MTSS1在转移性膀胱癌组织中表达缺失，而能在正常膀胱组织及非转移性膀胱癌组织中表达。后续的研究表明，在多种肿瘤组织中（如食道癌、乳腺癌、肾癌）MTSS1低表达或不表达，与其在正常组织中的表达有差异[8-9]。

但对MTSS1与肿瘤的关系还存在争议，因为有研究发现其在肝癌和结肠癌组织中高表达，在正常组织中低表达[8，10]。在不同的癌组织内，MTSS1抑癌或促癌的作用也不同。因此有必要对MTSS1与人体不同部位的癌组织进行全面研究，但目前对MTSS1与胆囊癌关系的研究还很少。本研究表明，MTSS1在胆囊癌组织中低表达，在正常胆囊组织中高表达，MTSS1的表达与患者预后相关。这些结果提示MTSS1可能是一个胆囊癌的抑癌基因。

新生血管对肿瘤的生长和转移至关重要，通过检测肿瘤的微血管密度可以了解肿瘤组织的血供[11]。本研究表明，在胆囊癌组织中微血管密度较高，在正常胆囊组织中微血管密度低，微血管密度与患者预后相关。这些结果提示微血管密度可能是一个胆囊癌的促癌因素。

对MTSS1抑癌机制的研究表明其可能是通过调节细胞骨架的形态与功能从而抑制肿瘤的发生与转移。本研究提示MTSS1可能还对肿瘤新生血管的生成有影响。在MTSS1低表达的胆囊癌组织中，其微血管密度较高；在MTSS1高表达的胆囊癌组织中，其微血管密度较低。两者之间负相关。

总之，MTSS1蛋白广泛表达于正常胆囊组织，而在癌组织中的表达率降低。低表达的MTSS1、高的微血管密度和胆囊癌的恶性生物行为有关，它们是有效的胆囊癌预后指标。MTSS1有抑制胆囊癌进展的作用，其抑癌作用可能与影响肿瘤微血管密度有关。但其具体功能机制尚有待于进一步研究。

[1]KUROKI T,TAJIMA Y,MATSUO K,et al.Genetic alterations in gallbladder carcinoma[J].Surgery Today,2005,35(2):101-105.

[2]DUP,YE L,RUGEF,etal.Metastasissuppressor-1,MTSS1,actsasa putative tumour suppressor in human bladder cancer[J].Anticancer Research,31(10):3205-3212.

[3]LIU K,WANG G,DING H,et al.Downregulation of metastasis suppressor 1(MTSS1)is associated with nodalmetastasis and poor outcome in Chinese patientswith gastric cancer[J].BMCCancer,2010 (10):428.

[4]PARRC,JIANGW G.Metastasis suppressor 1(MTSS1)demonstrates prognostic value and anti-metastatic properties in breast cancer[J]. European JournalofCancer,2009,45(9):1673-1683.

[5]PASTUSHENKO I,VERMEULEN PB,CARAPETO F J,et al.Blood microvessel density,lymphatic microvessel density and lymphatic invasion in predicting melanoma metastases:systematic review and meta-analysis[J].the British Journal of Dermatology,2014,170(1): 66-77.

[6]MURAKAMI K,KASAJIMA A,KAWAGISHIN,et al.Microvessel density in hepatocellular carcinoma:Prognostic significanceand review of the previous published work[J].Hepatology Research:the Official Journalof the Japan SocietyofHepatology,2015,45(12):1185-1194.

[7]LEE Y G,MACOSKA JA,KORENCHUK S,et al.MIM,a potential metastasis suppressor gene in bladder cancer[J].Neoplasia,2002,4(4): 291-294.

[8]MA S,GUAN X Y,LEE TK,etal.Clinicopathological significance of missing in metastasis B expression in hepatocellular carcinoma[J]. Human Pathology,2007,38(8):1201-1206.

[9]DU P,YE L,LIH,et al.The tumour suppressive role ofmetastasis suppressor-1,MTSS1,in human kidney cancer,a possible connection with the SHH pathway[J].Journal of Experimental Therapeutics& Oncology,2012,10(2):91-99.

[10]WANGD,XUM R,WANGT,etal.MTSS1 overexpression correlates with poor prognosis in colorectal cancer[J].JournalofGastrointestinal Surgery,2011,15(7):1205-1212.

[11]沈令广,黄庆功,李俭银,等.血小板源性生长因子B在非小细胞肺癌中的表达及其与微血管密度的关系[J].中国现代医学杂志，2011,21(16):1841-1844.

（张西倩 编辑）

MTSS1 expression and m icrovessel density in gallbladder cancer and their clinical significance*

Yi-gang Chen,Chen Gu,Hong Zhou,Lu-bin Yao,Jia-zeng Xia,Su Qu
(Wuxi Second Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Wuxi,Jiangsu 214002,China)

ObjectiveTo investigate the expression of MTSS1 and microvessel density in gallbladder carcinoma, and analyze the relationships of MTSS1 and microvessel density with clinicopathological parameters and prognosis.MethodsA gallbladder carcinoma tissue chip successfully-constructed in our department was used.The chip contained tissue specimens from 118 patientswith gallbladder carcinoma.The expression of MTSS1 and microvessel density in gallbladder carcinoma were detected using immunohistochemistry.The relationships of MTSS1 and microvessel density with clinicopathological parameters were analyzed.The prognosis data were collected from 72 patients.The relationships of MTSS1 expression and microvessel density with prognosis of gallbladder carcinoma were analyzed using the univariate and multivariate survival analyses.ResultsThe positive expression rate of MTSS1 in the gallbladder carcinoma tissues was 44.1%(52/118),and the microvessel density was(52.80±1.94)in the gallbladder carcinoma tissues and(29.33±2.97)in the normal gallbladder tissues.Low expression of MTSS1 was related to TNM staging,lymph metastasis and degree of differentiation of gallbladder carcinoma(P＜0.05).High microvessel density was related to TNM staging and liver metastasis of gallbladder carcinoma(P＜0.05).The expression of MTSS1 was negatively correlated with microvessel density.Kaplan-Meier and Cox survival analyses showed that MTSS1 and microvessel density were independent prognostic factors in patients with gallbladdercarcinoma.ConclusionsMTSS1 protein iswidely expressed in normal gallbladder tissues,and the expression rate is significantly lower in gallbladder cancer tissues.Low expression of MTSS1 and high microvessel density are related tomalignantbiological behaviors of gallbladder carcinoma.They are effective indexes for the prognosis of gallbladder cancer.MTSS1 can inhibit the progression of gallbladder cancer and its tumor-suppressive effectmay be related to the influence of tumormicrovessel density.But its specificmechanism remains to be further studied.

gallbladder carcinoma;metastasis;MTSS1;microvessel density

R 604；R 735.8

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.010

1005-8982（2017）07-0046-04

2016-12-07

江苏省卫生厅科研立项（No：H201347）

瞿甦，E-mail：361865671@qq.com；Tel：13506187399