水产种苗中氯霉素残留量的测定前处理方法的改进

胡浩光　彭家杰　刘少彬　李绪鹏

摘要：本文对气相色谱法测定水产种苗中氯霉素的各种影响因素进行探讨，分析了样品提取和脱脂净化过程对检测结果的影响，并对上述环节进行改进。结果表明：改进后的前处理，实验成本低，加快实验速度，提高了回收率，适用于批量样品同时检测工作的需要。

关键词：氯霉素；水产品；气相色谱；前处理

中图分类号：0657.7 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20161232003

氯霉素（chloramphenicol）是由委内瑞拉链丝菌产生的抗生素。属抑菌性广谱抗生素，被广泛用于治疗各种敏感菌感染，故此在水产养殖业中被得到广泛应用。但由于氯霉素能抑制骨髓造血功能，造成过敏反应，引起再生障碍性贫血（包括白细胞减少、红细胞减少、血小板减少等），此外还可引起肠道菌群失调及抑制抗体形成）等危害，严重威胁人体健康，已成为人类的隐形杀手。因此对于水产养殖药物残留的检测尤见重要。目前对于氯霉素药物残留的检测方法，主要有GC法、酶联免疫法（ELISA）、负化学源GC-MS测定法、LC法、超高效液相法、LC-MS-MS法、微生物法、放射免疫法等。目前检测机构主要采用气相色谱法，但由于其样品前处理过程繁琐复杂，耗时长，易出现回收率偏低的情况，对于批量样品的检测，尤见不合适。为此本文根据实际检测工作，在行业标准DB44/T 543 2008的基础上，探讨并改进了提取、萃取等影响检测的环节，对前处理进行简化，进一步提高方法的回收率和简化前处理步骤，节省测定时间和成本，进一步优化各个要素，提高了回收率和工作效率。

1材料与方法

1.1标准品与试剂

氯霉素标准品，纯度≥98.5%（德国Dr.EhrenstorferGmbH公司）；甲醇、乙酸乙酯，正己烷均为色谱纯（美国Fisher scientific飞世尔实验器材（上海）有限公司）；试验用水为超纯水（东莞市怡丰贸易有限公司），18.2MΩ.cm；无水硫酸钠为分析纯（在马弗炉中650℃灼烧4h，冷却后置干燥器内中备用）；氯化钠为优级纯（汕基金项目：东莞市科技计划资助项目（项目编号：K10017K）头市西陇化工有限公司）；衍生化试剂：BSTFA/TMCS体积比为99：1（美国Supelco公司），Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2仪器与设备

气相色谱7890（美国安捷伦公司）；离心机（德国SIGMA公司）；电子天平：感量0.0001；MS1涡旋振荡器（德国IKA公司）；KQ-300VDE型超声波提取仪（昆山市超声仪器有限公司），氮吹仪（美国），超纯水仪（美國Millipore公司）。

1.3实验方法

1.3.1样品提取

准确称取均质水产种苗样品1.00g于15mL聚四氟乙烯离心管中，加入5mL乙酸乙酯，旋涡混合器混合30s，超声10min，4000ffmin离心3min。将乙酸乙酯层转移到50mL聚四氟乙烯离心管中，再重复提取1次，合并乙酸乙酯提取液于50mL聚四氟乙烯离心管中，于50～55℃水浴中吹氮蒸发至近干。

1.3.2脱脂净化

向离心管中加0.5 mL甲醇旋涡混合溶解残留物，加10 mL正已烷和10mL 4%氯化钠溶液，旋涡混合1.5min，充分混合提取脂肪，4000r/min离心3min，弃去正已烷相。水相中加入7mL乙酸乙酯，旋涡混合器混合1.5min，4000r/min离心3min，吸取乙酸乙酯层，经过无水硫酸钠柱脱水过滤于15mL具塞玻璃离心管中，再重复提取1次，用洗耳球挤压无水硫酸钠柱，在50-55℃水浴中吹氮蒸发至干。

1.3.3衍生化

向干的残留物中加100μL衍生物试剂，盖塞并旋涡混合10s，在70℃烘箱中反应30min。再在50～55℃水浴中，用氮气吹走多余的试剂，至样品管刚好吹干为止（注意：此步过长的吹干时间可导致丢失分析物）。加入1mL正已烷，旋涡混合10s，供气相色谱分析用。

1.4气相色谱测定

1.4.1气相色谱测定条件

色谱柱：HP-5石英毛细管柱（30m×0320mm×025gm），进样量1μL。脉冲不分流进样，脉冲压力为30psi，脉冲时间为0.75min。升温程序为：初温200℃，保持1min；20℃/min至250℃，保持10min，然后设定15℃/min升至280℃，保持2min。进样口温度26012，检测器温度为300～C。载气为氮气，流速1.2mL/min。外标法定量。

1.4.2标准溶液的配制

精确称取氯霉素标准品0.0250g，用甲醇溶解后定容到50mL容量瓶中，配制成500ug/mL的标准溶液，于冰箱冷藏储存。使用前根据需要稀释成不同浓度。

2结果与讨论

2.1条件优化

2.1.1样品转移的优化

DB44/T 543-2008的样品处理流程为“称样到离心管-转移到鸡心瓶-转移到离心管-转移到鸡心瓶-转移到具塞圆底离心管-吹干-定容”，如此反复的转移定会引起样品的损失，且耗时。本实验采用“称样到加塞10mL离心管-转移到50 mL离心管-15 mL离心管吹干-定容”。这样既减少了转移的次数和实验步骤，同时缩短了检测时间，减少了试剂用量，保证了回收率。

2.1.2浓缩和净化的优化

DB44/T 543-2008方法每次只能将一个样品用鸡心瓶在40℃水浴条件下减压旋转蒸发至干；而本实验中采用50mL的聚四氟乙烯离心管代替鸡心瓶，每次可同时处理24个样品，在氮吹仪上，于40℃水浴条件下，氮吹蒸发至干，操作简便快捷，浓缩效果明显提高。

在DB44/T 543-2008方法中，样品采用1次脱脂，2次反萃取，1次提取和2次蒸馏过程进行净化，纵然能达到较好的除杂效果，可耗时、繁琐、样品溶液转换次数较多，大大影响了实验回收率。而本实验对此进行改进，用离心管代替鸡心瓶，脱脂和反萃取的时候，进行离心，溶液分层清析，缩短了实验步骤。实验结果表明，该方法不仅提高净化效果，操作方便，降低检验成本，而且效果好，回收率满足日常检测要求。

2.2色谱图比较

分别采用DB44/T 543-2008方法（A）和改进后的方法（B），进行草鱼样品和草鱼加标样品的检测，得到图谱如图1-3所示。图1为氯霉素标准品色谱图；由图2和图3（草鱼基质和在草鱼基质添加0.2 mL 50ng/mL氯霉素）可以看出，采用方法A的干扰杂质相对较多，而且基线不平稳，按照实验方法1-3操作进行，采用方法B的图谱基线平稳，基线噪声低，干扰杂质相对较少，且目标物区分清晰。

2.3线性范围和检出限

用甲醇配制质量浓度依次为1.00、5.00、10.00、25.00、50.00、75.00和100.00ng/mL的氯霉素标准溶液，测定其峰面积相应值，以峰面积对应的质量浓度做工作曲线。当进样量为1μL时，氯霉素在质量浓度为0.5-100.00ng/mL的范围内呈良好的线性关系，线性方程为Area=34.1232795×Amt+8.6549223，线性系数r=0.9996。在本方法测定条件下，按信噪比S/N=3所对应的浓度为依据计算检出限，得到氯霉素的检出限为0.27μg/kg。

3回收率及精密度试验

取阴性样品，加入水平分别为5μg/kg、10μg/kg、和15μg/kg标样，每组水平7次平行样，按上述实验条件，进行加标回收率实验。试验数据见表1所列。氯霉素的回收率在74.6%～87.6%之间，重复性较好，RSD值为1.2%～1.9%，因此该方法的准确度和精确度均可以满足测定要求。

4结论

本实验在DB44/T 543-2008的基础上进行了改进，简化实验步骤，提高工作效率。结果表明，DB44/T 543-2008经本文改进后，回收率高，精密度好，适用于水产品中氯霉素留量的检测。