新型黑曲霉液体发酵及对黄曲霉毒素B1的脱除

张晓雪， 孙秀兰*， 张银志

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122）

新型黑曲霉液体发酵及对黄曲霉毒素B1的脱除

张晓雪1， 孙秀兰*1， 张银志2

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122）

对经紫外照射诱变制备的新型黑曲霉FS-UV1在马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）中的pH、蛋白质质量浓度、蛋白酶活性变化以及脱除机制进行了研究。在发酵过程中，pH值不断下降，由初始pH 5.9下降为1.83。蛋白质质量浓度在发酵48 h后达到最大，为10.07 g/L，而酸性蛋白酶活性则在72 h达到最高，为0.98 U/mL。新型黑曲霉FS-UV1孢子悬液对AFB1无脱除效果，而菌丝体对AFB1具有吸附作用，发酵液则对AFB1具有降解作用，其中发挥降解作用的可能是蛋白质。对FS-UV1在pH 7的模拟肠道环境中脱除黄曲霉毒素B1（AFB1）的效果进行了评价。脱除48 h时，在pH 7的模拟肠道环境中对AFB1的脱除率为87.3%。

新型黑曲霉；紫外诱变；AFB1；生物脱除

霉菌及其产生的毒素对食品及动物饲料的污染已然成为现今不可忽视的世界性难题，而霉菌所产生的次级代谢产物即毒素会引起动物体重减轻，影响肝肾脏功能，免疫抑制等严重疾病甚至死亡。而黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1简写为AFB1）作为公认毒性最强的毒素会引发肝癌及遗传毒性[1-2]。近年来，物理、化学、生物脱除毒素方法成为主要的脱毒方式[3-5]。而生物脱除方法因其与物理、化学方法相比脱除条件相对比较温和，不易对食品等原材料的营养成分及风味产生变化和环境友好型等优点受到关注与推崇。研究表明，某些真菌及细菌甚至生物碱能够有效抑制黄曲霉毒素B1的产生并对其具有降解作用，其中包括平菇、枯草芽孢杆菌、某些药用真菌等[6-8]，而这些真菌对AFB1的脱除机制与它们在发酵过程中的产生的胞外酶密切相关，研究发现，某些胞外酶可以破坏AFB1结构中的双呋喃环从而改变AFB1的荧光性质及毒性，并且已有研究人员成功纯化获得了胞外酶[9]。黑曲霉作为能够有效抑制黄曲霉毒素的产生及降解AFB1的微生物，已被报道并受到广泛关注[10]。作者对诱变获得的新型黑曲霉FS-UV1在PDB培养基中pH等指标的变化进行了研究，并对其降解AFB1的效果进行了评价。早期为了研究对毒素的脱除效果所进行的体外试验大多是在中性环境下进行的，但考虑到实际应用中肠道环境的复杂性及方法的简便性，模拟肠道成为了一种既简便又能最大程度上还原实际肠道环境的有效方法。作者使用模拟肠道来评价新型黑曲霉FS-UV1对AFB1的脱除效果，不仅为后期的体内动物实验提供了参考，还为实际应用的可行性提供了可靠的数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

新型黑曲霉菌株FS-UV1：保藏于武汉微生物保藏中心，编号CCTCC M2013553；AFB1标准品：Sigma公司；乙腈：质谱纯，美国TEDIA公司。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：马铃薯300 g、葡萄糖20 g、琼脂20g、氯霉素0.1 g、蒸馏水1 L，自然pH，121℃高压灭菌15 min。马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB培养基）：马铃薯300 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 L、自然pH，121℃高压灭菌15 min。计数培养基：胰蛋白胨5.0 g，酵母浸膏2.5 g，葡萄糖1.0 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L，pH（7.0±0.2），121℃高压灭菌15 min。

1.2 设备

DGG-9123AD电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；LS-B50L立式圆形压力蒸汽灭菌器：上海医用核子仪器厂；SW-CJ-1D洁净工作台：苏州净化设备厂生产；MJ-180B霉菌培养箱：上海跃进医疗器械厂；AB204-N电子天平：梅特勒-托利多国际贸（上海）有限公司；安捷伦1100高效液相色谱系统：美国安捷伦公司；PB-10/C标准型PH计：上海精密仪器有限公司；WFH-203B三用紫外分析仪：上海精科实业有限公司生产。

1.3 实验方法

1.3.1 新型黑曲霉FS-UV1的液体发酵 将PDA斜面上黑曲霉菌株点接到固体平板中央，进行菌体活化，30℃恒温培养箱培养5 d，取出放于4℃冰箱保存备用。用适量的生理盐水洗脱斜面培养基中的孢子，在预先灭菌的带玻璃珠的三角瓶中充分摇匀，并用灭菌的脱脂棉过滤以除去菌丝，稀释成5×106个/mL孢子悬液。将上述菌悬液接种到种子培养基中，30℃、150 r/min霉菌培养箱中培养至直径为2 mm左右的菌丝球出现，并按照10%的接种体积分数接种至5 L发酵罐发酵48 h。

1.3.2 发酵过程中pH的测定 测定灭菌后PDB培养基的pH，并在发酵过程中每隔6 h取样15 mL，测定发酵液中pH值，记录发酵过程中的pH值的变化。

1.3.3 发酵过程中蛋白质质量分数的测定 测定灭菌后PDB培养基的蛋白质质量分数，并在发酵过程中每隔6 h取样15 mL，考马斯亮蓝法测定发酵液中蛋白质质量分数，记录比较发酵过程中的蛋白质质量分数的变化。

1.3.4 发酵过程中酸性蛋白酶活性的测定 测定灭菌后PDB培养基的酸性蛋白酶活性，并在发酵过程中每隔6 h取样15 mL，根据GB/T23527-2009测定发酵液中酸性蛋白酶活性，记录比较发酵过程中的酸性蛋白酶活性的变化。蛋白酶活性（活力）为1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/mL表示。

1.3.5 新型黑曲霉FS-UV1在模拟肠道中对AFB1的脱除效果 准确称取KH2PO4（6.805 g）NaOH（0.896 g）溶解于1 L去离子水中，并调节pH为7±0.2[11]。取10 mL pH（7±0.2）的肠道模拟液，向其中加入等体积的新型黑曲霉FS-UV1 48 h发酵液，然后加入AFB1标准液使其终质量浓度为8.0 μg/mL，测定不同降解时间新型黑曲霉FS-UV1对AFB1的脱除率。

1.3.6 新型黑曲霉FS-UV1脱除机制研究 向无菌试管中分别加入方法1.3.1制备的孢子悬液9 mL，之后向试管中加入1 mL AFB1使其终质量分数为0.5 μg/g，混匀后于30℃、150 r/min避光反应48 h，测定AFB1脱除率。取发酵48 h的发酵液纱布过滤后获得菌丝体，并将其分为以下两组：121℃处理20 min和未做处理。两组的菌丝体于无菌试管中，各加入10 mL生理盐水-AFB1（终浓度为0.5 μg/g）溶液悬浮起来，摇匀后于30℃、150 r/min避光反应48 h，测定AFB1的脱除率。将上述过滤获得的发酵液并将其分为以下两组：硫酸铵沉淀处理和未处理组；加入AFB1（质量分数为0.5 μg/g）混匀后于30℃、150 r/min避光反应48 h，测定AFB1脱除率[5]。

1.3.7 AFB1的提取与测定 吸取1 mL滤液，用3倍体积的氯仿提取滤液中AFB1，静置分层，收集氯仿层，氮气吹干，加入100 μL三氟乙酸和200 μL正己烷，混匀后于40℃避光反应15 min，再次氮气吹干，1 mL流动相（乙腈∶水=20∶80）溶解AFB1的衍生物，0.22 μm膜过滤，保存于棕色瓶，待测。高效液相色谱检测条件参考文献[12]测定[12]。

2 结果与分析

2.1 新型黑曲霉FS-UV1的液体发酵过程中pH的变化

新型黑曲霉FS-UV1在PDB培养基发酵过程中pH的变化见图1。pH由初始培养基中的pH 5.9下降为1.83并趋于平衡。发酵过程中pH值的变化是微生物代谢反应的综合结果，pH与培养基的组成及微生物的代谢途径均有着密切的关系。pH的下降可能是由菌体对培养基中糖的利用并产生有机酸造成的；而在发酵后期菌体发生自溶pH会随之下降，与此同时菌体蛋白酶的活跃致使pH值又呈上升趋势，二者综合作用致使总的pH值没有发生明显的变化并趋于平衡[13]。

2.2 新型黑曲霉FS-UV1的液体发酵过程中蛋白质质量浓度的变化

图2中显示了新型黑曲霉FS-UV1在PDB培养基发酵过程中蛋白质质量浓度的变化。发酵液中的蛋白质质量浓度在48 h时达到最大，为10.07 g/L，之后蛋白质质量浓度呈现下降趋势并在72 h趋于平衡[14-15]。蛋白质质量浓度变化与脱除率的关系见图2。可以看出，当蛋白质质量浓度达到最高时，脱除率也达到最大，可知蛋白质与脱除率密切相关。

图1 新型黑曲霉FS-UV1在PDB培养基发酵过程中pH的变化Fig.1 pH change during the permentation of the new Aspergillus niger FS-UV1 in PDB medium

图2 新型黑曲霉FS-UV1在PDB培养基发酵过程中蛋白质质量浓度变化及对AFB1的脱除效果Fig.2 Protein content change and AFB1removal effect during the permentation of the new Aspergillus niger FS-UV1 in PDB medium

2.3 新型黑曲霉FS-UV1的液体发酵过程中酸性蛋白酶活性的变化

图3所示为新型黑曲霉FS-UV1在PDB培养基发酵过程中酸性蛋白酶活性的变化。酸性蛋白酶活性在72 h时达到最大，为0.98 U/mL，并在144 h趋于平衡。

2.4 新型黑曲霉FS-UV1在模拟肠道中对AFB1的脱除效果

结果表明：新型黑曲霉FS-UV1在PDB培养基中发酵48 h后，对AFB1的脱除效果见图4。新型黑曲霉FS-UV1对AFB1的脱除率随时间的延长而升高，并在48 h达到87.3%，见图4。

图3 新型黑曲霉FS-UV1在PDB培养基发酵过程中酸性蛋白酶活性的变化Fig.3 Acid protease activity change during the permentation of the new Aspergillus niger FSUV1 in PDB medium

图4 新型黑曲霉FS-UV1在模拟肠道中不同降解时间对AFB1的脱除效果Fig.4 AFB1removal effect of the new Aspergillus niger FS-UV1 by different times in simulated intestinal tract

2.5 新型黑曲霉FS-UV1对AFB1脱除机制研究

为了研究FS-UV1对AFB1的脱毒作用机制，分别对孢子悬液、菌丝体、发酵液对AFB1的脱毒作用进行了研究[16-17]，结果见图5。其中孢子悬液对AFB1几乎没有脱除作用，而菌丝体及发酵液可有效的脱除AFB1，脱除率分别达到20.01%、50.1%；而在热处理前后菌丝体对AFB1的脱除能力未发生显著变化，说明菌丝体是通过物理吸附达到对AFB1的脱除，而发酵液在经过硫酸铵沉淀后对AFB1的脱除能力发生了显著性变化，由50.1%下降到10.9%，说明发酵液中发挥脱毒作用的很可能是蛋白质。

图5 新型黑曲霉FS-UV1孢子、发酵液及菌丝体对AFB1的脱毒效果比较Fig.5 Comparision of AFB1 removal effectt by the new Aspergillus niger FS-UV1 spore，fermentation broth and mycelium

3 结语

1）在发酵过程中，pH值不断下降，由初始pH 5.9下降为1.83。 蛋白质质量浓度在发酵48 h达到最大，为10.07 g/L；而酸性蛋白酶活性则在72 h达到最高，为0.98 U/mL。新型黑曲霉FS-UV1发酵过程中pH、蛋白质量浓度及酸性蛋白酶活性的变化对后期研究提取发酵液中胞外酶的条件提供了参考数据。

2）脱除时间为48 h时，在pH 7的模拟肠道环境中对AFB1的脱除率为87.3%。

3）FS-UV1孢子悬液对AFB1无脱除效果，而菌丝体对AFB1具有吸附作用，发酵液则对AFB1具有降解作用，其中发挥降解作用的可能是蛋白质。

[1]MENDEZ-ALBORES A，DEL Rio-Garcia J，MORENO-MARTINEZ E，et al.Decontamination of aflatoxin duckling feed with aqueous citric acid treatment[J].Animal Feed Science and Technology，2007，135：249-262.

[2]NEEFF D V，LEDOUX D R，ROTTINGHAUS G E，et al.In vitro and in vivo efficacy of a hydrated sodium calcium aluminosilicate to bind and reduce aflatoxin residues in tissues of broiler chicks fed aflatoxin B-1[J].Poultry Science，2013，92：131-137.

[3]TENIOLA O D，ADDO P A，BROST I M，et al.Degradation of aflatoxin B1 by cell-free extracts of Rhodococcus erythropolis and Mycobacterium fluoranthenivorans sp.nov.DSM44556T[J].International Journal of Food Microbiology，2005，105：111-117.

[4]CHENG Ji，ZHAO Lihong.The outlook and research of biodegradation of AFB1[J].Joural of Animal Nutrition，2010，22：241-245.（in Chinese）

[5]LI Bing，DONG Zhengying，CHANG Weishan.The degradation and application of AFB1by Aspergillus niger[J].Joural of Feed Exposition，2013：6-10.（in Chinese）

[6]MOTOMURA M，TOYOMASU T，MIZUNO K，et al.Purification and characterization of an aflatoxin degradation enzyme from Pleurotus ostreatus[J].Microbiological Research，2003，158：237-242.

[7]WESENBERG D，KYRIAKIDES I，AGATHOS S N.White-rot fungi and their enzymes for the treatment of industrial dye effluents[J].Biotechnology Advances，2003，22：161-187.

[8]ZHAO L H，GUAN S，GAO X，et al.Preparation，purification and characteristics of an aflatoxin degradation enzyme from Myxococcus fulvus ANSM068[J].Journal of Applied Microbiology，2011，110：147-155.

[9]ALBERTS J F，GELDERBLOM W C A，BOTHA A，et al.Degradation of aflatoxin B1 by fungal laccase enzymes[J]. International Journal of Food Microbiology，2009，135：47-52.

[10]XU D，WANG H，ZHANG Y，et al.Inhibition of non-toxigenic Aspergillus niger FS10 isolated from Chinese fermented soybean on growth and aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus[J].Food Control，2013，32：359-365.

[11]THIEU N Q，PETTERSSON H.In vitro evaluation of the capacity of zeolite and bentonite to adsorb aflatoxin B1 in simulated gastrointestinal fluids[J].Mycotoxin Research，2008，24：124-129.

[12]XU Dan，SUN Xiulan.Inhibition of non-toxigenic Aspergillus niger FS10 isolated from Chinese fermented soybean on growth and aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus[J].Journal of China Microecology，2011，23：490-492.（in Chinese）

[13]LIU Min，OUYANG Jia，YONG Qiang，et al.The preparation of β-glucosidase by fermentation of the Aspergillus niger[J]. Journal of Engineering of Biology and Chemistry，2008（5）：5-8.（in Chinese）

[14]LI Ping，WAN Xiaochun，TAO Wenxi，et al.High yield β-glucosidase of Aspergillus niger by compound mutation[J].Journal of System of Bacteria，2000，19（1）：117-121.（in Chinese）

[15]CHEN Xiwei.The discussion of influence in fermentation and regulation control of citric acid by pH[J].Journal of Technology of Modern Agriculture，2009（5）：11-12，15.（in Chinese）

[16]MCLEAN M，DUTTON M F.Cellular interactions and metabolism of aflatoxin：An update[J].Pharmacology&Therapeutics，1995，65：163-192.

[17]PELTONEN K，EL-NEZAMI H，HASKARD C，et al.Aflatoxin B1 binding by dairy strains of lactic acid bacteria and bifidobacteria[J].Journal of Dairy Science，2001，84：2152-2156.

AFB1Decontamination and Fermentation
of the Novel Aspergillus niger FS-UV1

ZHANG Xiaoxue1， SUN Xiulan*1， ZHANG Yinzhi2
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2．State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In this paper，the changes in pH，protein，protease activity and the degradation mechanism of the new Aspergillus Niger FS-UV1 which was induced by ultraviolet irradiation in potato glucose liquid medium （PDB）were studied.It is found that the pH value is declining in fermentation process，which dropped from the initial 5.9 to 1.83.The protein content showed the maximum of 10.07 g/L at 48 h，and protein activity reached the highest at 72 h with 0.98 U/mL.The experimental results showed that AFB1could be decontaminated by mycelium and culture filtrate，and the spores had effect on AFB1.In addition，FS-UV1 degraded aflatoxin B1（AFB1）effect was evaluated in simulation intestinal environment of pH=7 and the degradation rate was 87.3%.

novel Aspergillus niger，ultraviolet irradiation，AFB1，biodegradation

TS 201.3

A

1673—1689（2017）03—0266—05

2015-03-02

国家973计划项目（2012CB720804）。

*通信作者：孙秀兰（1976—），女，山东聊城人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事食品安全监测方面的研究。

Email：sxlzzz@jiangnan.edu.cn

张晓雪，孙秀兰，张银志.新型黑曲霉液体发酵及对黄曲霉毒素B1的脱除[J].食品与生物技术学报，2017，36（03）：266-270.