静脉注射全氟化碳预处理与后处理对急性肺损伤大鼠的影响

尹晓峰，钱国强△，樊毫军,宋建奇

(1.黄淮学院护理学院,河南驻马店 463000；2.武警医学院附属医院医教部,天津 300162)

论著·基础研究

静脉注射全氟化碳预处理与后处理对急性肺损伤大鼠的影响

尹晓峰1，钱国强1△，樊毫军2,宋建奇2

(1.黄淮学院护理学院,河南驻马店 463000；2.武警医学院附属医院医教部,天津 300162)

目的 探讨静脉注射全氟化碳(PFC)预处理与后处理对脂多糖(LPS)致急性肺损伤大鼠的保护作用及相关作用机制。方法 选取24只雄性Wistar大鼠分为对照组(NS组)、LPS组、PFC预处理组(Pre组)和PFC后处理组(Post组)。NS组均以等量生理盐水作对照，LPS组经气管内滴注LPS；Pre组于气管内滴注LPS前经股静脉注射PFC； Post组于气管内滴注LPS后经股静脉注射PFC。NS组于气管内滴注生理盐水后6 h，LPS组、Pre组与Post组分别于滴注LPS后6 h处死动物。比较各组大鼠肺病理学变化，PaO2，肺湿干比(W/D)，肺髓过氧化物酶(MPO)及细胞黏附分子-1(ICAM-1)表达情况。结果 应用PFC明显升高PaO2，降低肺W/D比值、MPO活性及ICAM-1表达水平(P<0.05)，而且Pre组较Post组作用更显著。结论 静脉注射PFC对ALI具有保护作用，以PFC预处理效果更为显著，其机制可能与下调ICAM-1表达有关。

呼吸窘迫综合征，成人；脂多糖；全氟化碳；细胞黏附分子-1；中性粒细胞

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS) 是由严重感染、创伤、休克、中毒及吸入有害气体等各种致病因素导致的急性呼吸功能不全或衰竭，临床以呼吸窘迫、顽固性低氧血症和非心源性肺水肿为特征，是临床常见的急危重症，病死率极高。其发病机制迄今尚未完全阐明，目前普遍认为肺内过度失控性炎症反应，炎性介质和抗炎介质二者失衡，最终引起不可逆性病变是导致ALI/ARDS发生的根本原因[1-2]。因此，积极寻找抑制炎症反应，减轻病理损伤的方法是治疗ALI/ARDS的关键所在。研究表明，全氟化碳(perfluorocarbon，PFC)具有的理化特性能够提高肺顺应性，改善ALI动物模型的氧合功能和呼吸力学指标[3]。但是目前关于PFC在ALI的应用研究主要是通过采用部分液体通气技术，需要建立人工气道，不便对早期尚未插管的患者进行干预。鉴于此，本研究考虑对ALI大鼠损伤前后进行静脉滴注PFC途径给药，观察其对PMN浸润及病理损伤的影响，并对作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠24只，由军事医学科学院实验动物中心提供，体质量180～220 g。实验试剂：PFC(北京天水生物科技公司)；脂多糖(LPS，美国Sigma公司)；髓过氧化物酶(MPO)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠抗大鼠细胞黏附分子-1(ICAM-1)单克隆抗体(美国Abcam公司)；免疫组织化学染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制备及实验分组 24只健康雄性Wistar大鼠分为4组：(1)对照组(NS组)，给予等体积生理盐水作对照。(2)脂多糖组(LPS组)，大鼠以2%戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉，将动物取仰卧位固定于实验台上，逐层暴露气管，以0.5 mL/kg LPS溶液进行气管内滴注，药物注入完毕将大鼠取直立位并旋转，便于药液均匀分布。(3)PFC预处理组(Pre组)，于气道滴注LPS前30 min经股静脉注射PFC(6 mL/kg)。(4)PFC后处理组(Post组)，于气道滴注LPS后30 min经股静脉注射PFC(6 mL/kg)。

表1 各组PaO2、W/D、MPO、ICAM-1比较

*:P<0.05，与NS组比较；#:P<0.05，与LPS组比较；▲:P<0.05，与Pre比较。

A：NS组；B：LPS组；C：Pre组；D：Post组。

图1 各组肺组织病理学变化(×400)

A：NS组；B：LPS组；C：Pre组；D：Post组。

图3 各组肺组织ICAM-1的表达(×400)

1.2.2 标本采集与检测 滴注LPS或NS后6 h取腹主动脉血行血气分析并放血处死动物，开胸取全部左肺，滤纸吸干表明水分和血液，称取湿质量(W)，置80 ℃干燥箱烘烤48 h，称取干质量(D)，计算肺湿干比(W/D)；取右肺上叶和中叶用10%乙醇溶液固定，常规石蜡包埋切片，用于HE染色及免疫组织化学分析肺组织ICAM-1的表达情况；取右肺下叶置于离心管，并放于低温冰箱中保存，采用比色法测定肺组织MPO活性，具体操作步骤严格按照说明书步骤进行。

1.2.3 肺组织ICAM-1表达的判定标准 采用Image-proplus医学图像分析系统处理，以光密度平均值代表ICAM-1的表达强度。

2 结 果

2.1 动脉血氧分压(PaO2)比较 与NS组比较，LPS组PaO2显著降低(P<0.05)，PFC可显著提高ALI大鼠PaO2，但仍低于NS组(P<0.05)，并且Pre组较Post组对PaO2提升作用更明显(P<0.05)，见表1。

2.2 肺W/D变化 LPS组较NS组大鼠肺W/D明显增加(P<0.05)，PFC可明显降低ALI大鼠肺W/D，并且Pre组比Post组大鼠肺W/D更低(P<0.05)，见表1。

2.3 肺组织病理学观察 与NS组大鼠肺组织比较，LPS组光镜下可见肺组织结构破坏明显，肺泡毛细血管扩张充血，肺泡壁破裂，间隔增宽，大量PMN等炎症细胞浸润，伴出血及肺间质水肿；应用PFC减轻ALI大鼠肺组织病理损伤程度，光镜下可见肺间隔轻度增宽、无明显出血，少量炎性细胞浸润，见图1。

2.4 肺组织MPO活性的比较 与NS组比较，LPS组大鼠肺组织MPO活性显著升高(P<0.05)；与LPS组比较，Pre组和Post组MPO活性明显降低(P<0.05)，并且Pre组比Post组大鼠肺MPO活性更低(P<0.05)。见表1。

2.5 肺组织ICAM-1的表达 NS组ICAM-1未见明显表达；LPS组则表达明显增多，可见血管内皮细胞、支气管上皮细胞及肺泡上皮细胞有棕黄色或深棕色颗粒，染色较深；Pre组和和Post组表达相对减少，染色较浅(图2)。图像分析结果表明，与NS组比较，LPS组ICAM-1光密度平均值明显增高(P<0.05)。Pre组和和Post组与LPS组比较ICAM-1光密度平均值显著降低(P<0.05)，但高于对照组(P<0.05)，并且Pre组比Post组大鼠肺ICAM-1光密度平均值更低(P<0.05)。

3 讨 论

近年来，大量研究表明以PFC作为通气媒介的部分液体通气技术在治疗ALI/ARDS上取得了理想的效果，可显著改善ALI动物的氧合功能和肺顺应性，稳定血流动力学状态，减轻肺损伤，降低实验动物的病死率，并且无明显不良影响[4-7]。然而，这些措施需要建立人工气道以便于PFC进入肺部发挥作用，因而并不适用于早期尚未插管患者的治疗。因此，在本实验选择了静脉注射方式给予PFC乳液，观察和评价其对ALI大鼠的影响，并在大鼠造模前后分别给予同等剂量的PFC，观察比较二者对ALI大鼠相应指标的影响，旨在评价不同时点静脉注射PFC对ALI大鼠的效果。

本实验表明，对LPS诱导的ALI大鼠采取静脉注射给予PFC能够明显改善ALI大鼠的肺功能，提高PaO2，降低肺W/D，减轻肺水肿，减轻肺组织病理损伤，其可能和PFC抑制ICAM-1表达，减少PMN肺组织浸润有关。这些结果提示PFC对于ALI患者，尤其是早期患者可能具有一定的临床应用价值。

ALI/ARDS是一种由多种致病因素引发的全身炎症反应和自身代偿抗炎反应失调，从而损伤器官，肺脏往往成为所累及的首位靶器官[8]。目前，ALI/ARDS的发病机制尚未完全阐明，有待进一步深入研究。其中，PMN在肺内聚集、激活，并释放蛋白酶、氧自由基和炎性介质等，以及其他炎症细胞的参与在ALI/ARDS的发病起着重要的作用[5]。正常情况下ICAM-1表达有着严格的调控机制,在LPS等刺激因素的作用下,毛细血管内皮细胞上ICAM-1表达上调，PMN与毛细血管内皮细胞之间的黏附作用增强,进而大量聚集，游出肺血管床，进入肺泡腔，促进炎症的发生、发展，造成肺组织损伤[9]。

目前，关于PFC在ALI的应用研究主要是通过采用部分液体通气技术及汽化吸入，而对静脉注射给药途径研究较少。大量研究表明，应用PFC对于ALI/ARDS具有保护意义，但保护作用机制尚有待研究。PFC 是一类碳氢化合物中的氢原子被氟原子取代后形成的化合物，它可以在呼吸道内发挥良好的气体转运功能。大量研究表明，PFC具有广泛的非特异性抗炎效应，能够明显减少炎症细胞的趋化、聚集和浸润，并能抑制炎性介质的释放，对ALI具有重要的保护作用，PFC的非特异性抗炎效应可能是其对于ALI重要的保护机制之一。Rüdiger等[10]研究发现，PFC能够促进肺泡表面活性物质的分泌，降低肺泡表面张力，减少肺不张，有利于肺通气。Nakata等[11]研究发现，循环系统内的PFC乳剂能够通过弥散作用到达肺血管内皮细胞、肺泡上皮细胞等，作为一个物理屏障阻挡炎症细胞、炎性介质等对肺组织的损害，进而发挥其保护作用。本实验研究结果表明，PFC明显提高PaO2,降低肺组织MPO活力，减轻PMN的肺内浸润程度，减轻LPS致ALI大鼠肺损伤程度。在LPS刺激下,肺组织ICAM-1表达明显增高，PMN与血管内皮细胞黏附、游走与渗出，向炎症部位积聚，加强炎症反应，造成肺组织损伤持续加重。本研究结果提示,PFC可明显下调LPS致ALI时ICAM-1在肺组织的表达,减轻肺组织炎症反应，提示PFC可能通过下调ICAM-1，减少PMN浸润，减轻炎症反应对ALI大鼠发挥保护作用。

本研究通过对ALI大鼠造模前后进行静脉注射PFC并进行比较发现LPS行气道滴注前应用PFC相较LPS行气道滴注后应用PFC能够更有效的提高PaO2,减少肺组织ICAM-1表达，降低PMN肺组织浸润，减轻肺组织病理损伤，对于ALI大鼠具有更强的保护作用，该结果出现的原因可能与应用PFC进行预处理时能够使其在LPS进入肺内之前覆盖于肺泡表面，更好地发挥其屏障保护作用，从而显著降低了LPS对肺组织的损伤作用；而PFC后处理组则由于应用LPS在前，使得肺组织损伤提早形成，再应用PFC仅能起到一定的治疗效果。

综上所述，静脉注射PFC对ALI具有保护作用，该给药途径不需要建立人工气道，更适用于早期ALI，并且PFC预处理和后处理两种给药时点比较，预处理对于ALI肺功能改善，肺组织病理损伤减轻效果更显著，而且通过本研究表明PFC的保护作用机制可能与PFC下调ICAM-1表达，进而减少PMN肺组织浸润有关，这也为临床静脉注射PFC防治ALI/ARDS提供了理论基础。

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Effect of intravenous infusion with perfluorocarbons pretreatment and posttreatment on acute lung injury in rats

YinXiaofeng1,QianGuoqiang1△,FanHaojun2,SongJianqi2

(1.DepartmentofNursing,HuanghuaiCollege,Zhumadian,Henan463000,China;2.DepartmentofMedicalEducation,theAffiliatedHospitalofMedicalCollegeofArmedPoliceForces,Tianjin300162,China)

Objective To investigate the protective effect and the possible mechanism of intravenous infusion with perfluorocarbon pretreatment and posttreatment on acute lung injury in rats on LPS-induced acute lung injury in rats.Methods A total of 24 Wistar rats were randomly divided into 4 groups:control group(NS group),LPS group,Pre group and Post group.Normal saline was given to NS group as a control.Rats were treated with LPS by intratracheal instillation in LPS group,rats received PFC through femoral vein prior to LPS instillation in Pre group and rats received PFC through femoral vein after LPS instillation in Post group.NS group were sacrificed at 6 h after being injected with NS,LPS group,Pre group and Post group were sacrificed at 6h after being given LPS.Pathological changes of lung,PaO2,lung wet to dry weight ratio(W/D),expression of myeloperoxidase (MPO) and intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) of lung were assessed.Results Intravenous infusion with perfluorocarbons increased PaO2,decreased W/D,MPO and ICAM-1 significantly (P<0.05),and this effect is more remarkable in Pre group.Conclusion Intravenous infusion of PFC significantly protects lung from acute lung injury,especially by pretreatment forms,probably by down-regulate the expression of ICAM-1.

respiratory distress syndrome,adult;lipopolysaccharide;perfluorocarbon;intercellular adhesion molecule-1;polymorphonucleral neutrophil

尹晓峰(1982-)，讲师，硕士，主要从事病理生理学研究。△

，E-mail:gqqian1@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.08.005

R361.2

A

1671-8348(2017)08-1020-03

2016-09-21

2016-11-16)