复合发酵菌株对乳中碳源利用能力的分析及菌株间互作关系预测

苏敦，刘松玲，马雨璇，王雅男，葛绍阳，任发政，杨子彪，母智深

(1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，呼和浩特 011500；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京市高等学校畜产品工程研究中心，北京 100083；3.大理农林职业技术学院大理 671003)

复合发酵菌株对乳中碳源利用能力的分析及菌株间互作关系预测

苏敦1,2，刘松玲2，马雨璇2，王雅男2，葛绍阳2，任发政2，杨子彪3，母智深1

(1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，呼和浩特 011500；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京市高等学校畜产品工程研究中心，北京 100083；3.大理农林职业技术学院大理 671003)

发酵乳制品具有风味、营养、功能等特性上的优势，在乳制品消费中比例逐年上升。本研究以菌株间碳源间的互作为中心，分析了传统酸奶发酵剂菌株利用碳源的能力及在不同碳源中的生长特性，对菌株间的相互作用进行分析预测。研究发现：所有菌株均能利用葡萄糖，嗜热链球菌C4和C1-2能利用乳糖，干酪乳杆菌CM1和嗜热链球菌C4能利用半乳糖；通过分析菌株在不同碳源中的生长速率及迟滞期，发现嗜热链球菌C4在乳糖中的迟滞期最短（1.30±0.02），其降解乳糖产生的葡萄糖和半乳糖供干酪乳杆菌CM1生长（2.84±0.16），随后嗜热链球菌C1-2利用乳糖生长（2.89±0.22）。在此发酵剂菌株中C4菌株为发酵产酸的关键菌株，其快速产酸能力促进产品的凝乳，其降解乳糖产生葡萄糖和半乳糖供其他菌株生长；干酪乳杆菌CM1快速利用半乳糖和葡萄糖的能力可进一步促进产品的凝乳；产酸较慢的嗜热链球菌C1-2是一株产黏的菌，能促进酸奶组织状态和良好质地的形成。本研究对菌株利用碳源能力的分析为复合发酵剂的开发提供了有效数据。

发酵剂；发酵乳；嗜热链球菌；干酪乳杆菌

发酵乳制品具有风味、营养、功能等特性上的优势，在乳制品消费中比例逐步上升，具有广阔的市场前景。发酵剂在发酵乳的生产过程中起重要作用，对发酵乳风味、质构等具有关键影响。但是目前为止，国内发酵乳生产所用的发酵剂多数依赖于进口，国内发酵剂研发与生产水平均处于较低水平。

发酵剂菌株是决定发酵剂质量的重要因素。其特性包括∶ 迅速产酸的能力，形成稳定平衡的风味及良好的质地能力。为了达到发酵剂的各种要求，目前成功应用的发酵剂多为多菌株复配。优良的复配发酵剂在发酵过程中形成稳定的微生态体系，各菌株之间通过竞争、互利共生、偏利共生、拮抗和寄生等关系，达到产品性能稳定，风味、质地优良的目的[1,2]。因此发酵剂菌株之间互作关系的研究得到了广泛的开展，并取得了大量的成果[3～5]。

乳中的乳糖是发酵剂在发酵过程中的主要碳源，菌株对乳糖及组成乳糖的单糖半乳糖、葡萄糖的降解及利用能力直接影响菌株间的互作关系及发酵剂的性质。大量的研究已经发现，常用发酵剂菌株如保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等对乳糖、半乳糖及葡萄糖的利用能力具有菌种及菌株之间的差异[6～9]。对这些菌株利用乳源碳源的能力分析将为发酵剂的复配提供理论支持。

除了成功应用的复合发酵剂以外，自然发酵乳制品的发酵剂更为稳定，应用更为成功的复合发酵剂，对其中菌株互作关系的分析将为优良商业发酵剂的开发提供新的思路。本研究从内蒙传统酸奶中成功分离到不同发酵特性的5株乳酸菌，对5株乳酸菌利用乳糖、半乳糖及葡萄糖的能力进行分析，为开发优良复合发酵剂提供有效数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

样品采自内蒙古自治区锡林郭勒盟东乌旗牧区的牧民家。

1.1.2 设备及仪器

ME2002电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；连续可调移液器，德国Eppendorf公司；ZDX35BI自动高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；DK-98-II2KW洁净工作台，天津泰斯特仪器公司；UF/ UVPL5124超纯水仪，美国Pall公司；DNP-9082电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；ELx808全自动酶标仪，美国BioTek仪器有限公司。

1.1.3 试剂

MRS液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏8g，酵母膏4g，葡萄糖18g，吐温801g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.058g，蒸馏水1000mL，调至pH7.0±0.2，121℃灭菌15min。

M17培养基：大豆胨5g，蛋白胨2.5g，酪蛋白胨2.5g，酵母浸粉2.5g，牛肉浸粉5g，乳糖5g，抗坏血酸钠0.5g，β-甘油磷酸钠19g，MgSO4·7H2O 0.25g，蒸馏水1 000mL，调至pH 7.0±0.2，121℃灭菌15min。

半合成培养基[10]：碳源（葡萄糖、半乳糖、乳糖）添加量0.1mol/L，细菌蛋白胨10g，酵母浸粉5g，磷酸氧二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二胺2g， MnSO4·4H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.58g，吐温-80 1g，CyS-HCl 0.5g，蒸馏水1 000mL，调至pH 7.0±0.2，121℃灭菌15min。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离

以无菌操作吸取样品1mL于9mL无菌生理盐水中，呈1∶10的稀释液，选择合适的稀释度。吸取0.2mL的稀释液，涂布于MRS、改良M17培养基固体平板。分别于37℃、43℃培养48h，观察菌落生长情况，挑取典型单菌落，并对单菌落进行革兰氏染色，挑取革兰氏阳性菌作为初步目的菌株，转接至MRS和改良M17平板纯化，4℃保存。

1.2.2 菌种纯化

无菌条件下，挑取MRS和改良M17平板上呈革兰氏阳性的菌落，在相应的平板上划线分离，在选定的温度下倒置培养48h，挑取单菌落进行镜检，直至确定所得的菌株已经纯化，作为试验菌株。

1.2.3 菌株DNA的提取

取1mL培养至对数生长末期的菌液，室温下10 000 r/min离心3min。加入200μL溶菌酶，反复吹打重悬，置于37℃培养箱恒温培养1h。分别加入350μL TE、30μL 10% 的SDS、20μL 蛋白酶K（20mg/mL），吹打混匀后65℃水浴10min。分别加入100μ L NaCl（5 mol/L）溶液、80μL CTAB，混匀后65℃水浴10min。加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），混匀，4℃条件下12 000r/min离心3min。将上清转入新的离心管中。重复上一步，直到看不见界面为止，以除去多糖和其他污染的大分子。用等体积的氯仿/异戊醇抽提，混匀，4℃条件下12 000r/min离心3min。将上清转入新管，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀至DNA沉淀，4℃条件下12 000r/min离心10min。除去上清液，加入1mL 70%乙醇进行洗涤。4℃条件下10 000r/min离心2min。弃上清，干燥沉淀，重溶于20～50μL TE。

1.2.4 菌株16S rRNA 的扩增

PCR扩增采用50μL体系，其中DNA模板2.5μL，Mastermix（内含酶及dNTPs等）25μL，引物UNIF、UNIR各1.25μL [UNIF：5′-AGAGTTTGATC (A/ C) TGGCTCAG-3′，UNIR：5′-TACGG (C/T) TACCTTGTTACGACTT-3′]，超纯水20μL。反应条件：94℃预变性3min；94℃变性15s，52℃退火30s，72℃延伸40s，循环30次；再72℃延伸5min。采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的片段大小是否正确。将检验正确的样品用胶回收试剂盒 (Tiangen) 进行PCR产物回收与纯化。

将纯化的样品交北京奥科鼎盛生物技术有限公司测序，并将结果与Genebank 数据库中的标准株进行比对。

1.2.5 生长曲线的测定

将第三代的5株乳酸菌分别以2%接种于MRS液体培养基、M17液体培养基（只对球菌）和不同碳源（葡萄糖、半乳糖、乳糖）半合成培养基，在37℃和43℃下培养24h，每隔1h测一次OD值（波长600nm），每个样品做3个平行。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定结果

表1 菌株鉴定结果

通过菌株分离、DNA提取、16S rDNA PCR扩增，从发酵剂中成功获得5株菌，分别为嗜热链球菌C1-2，嗜热链球菌C4，保加利亚乳杆菌LB3，嗜酸乳杆菌CM5和干酪乳杆菌CM1，见表1。

2.2 菌株在不同碳源条件下的生长情况

2.2.1 菌株对碳源的利用范围

由图1可知，从传统酸奶分离得到的各菌株利用乳源碳源的范围不同。其中，Streptococcus thermophilus C4、Lactobacillus acidophilusCM5可以在乳中常见的全部三种碳源中生长；Streptococcus thermophilus C1-2 可以在乳糖及葡萄糖中生长，而不能在半乳糖中生长；Lactobacillus casei CM1不能利用乳糖，而能利用半乳糖和葡萄。在本实验条件下Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusLB3生长速度缓慢，其原因可能在于该菌株对营养要求较高，实验所用半合成培养基中的氮源不能满足菌株生长的需要[11,12]。该菌株在酸奶发酵过程中的氮源营养可能依赖于其他菌株对乳蛋白的降解，所以在所研究复合发酵菌株体系内可能还存在菌株间的氮源营养物质的互作[13]。

表2 生长曲线参数

2.2.2 菌株在不同碳源中的生长速度

图1 菌株在不同碳源中的生长曲线A:C1-2 B：C4 C:CM1 D:CM5 E:LB3

比较各菌株在不同碳源中的生长速度可知，Streptococcus thermophilus C1-2在葡萄糖中的生长速率高于乳糖；Streptococcus thermophilus C4在乳糖中的生长速率最大，其次为葡萄糖，最慢为半乳糖；Lactobacillus casei CM1在葡萄糖中的生长速率与在半乳糖中相近；Lactobacillus acidophilusCM5 在乳糖中的生长速率大于半乳糖，在葡萄糖中的生长速率最低。在不同糖中的生长速率可能反映了菌株在乳源环境中对多种碳源的选择性。在发酵初期，乳中仅存在为降解的乳糖，在发酵过程中由于微生物的降解，乳糖逐步降解为半乳糖和葡萄糖[14]。所以利用乳糖最快的Streptococcus thermophilus C4 及Lactobacillus acidophilus CM5可能在发酵初期生长较快，在发酵末期生长较慢；而在葡萄糖和半乳糖中生长较快的Streptococcus thermophilus C1-2和 Lactobacillus casei CM1可能在发酵过程中随着环境中的葡萄糖和半乳糖含量的增加生长速度逐步加快。尤其是不能利用乳糖的Lactobacillus casei CM1，只能利用其他菌株降解乳糖产生的葡萄糖和半乳糖。

2.2.3 在同类碳源中不同菌株的生长速度比较

在乳糖中能生长的菌株包括：Streptococcus thermophilus C4，Streptococcus thermophilus C1-2 和Lactobacillus acidophilusCM5。就生长速度而言，Streptococcus thermophilus C4大于Streptococcus thermophilus C1-2。在半乳糖中能生长的菌株为Lactobacillus casei CM1大于Streptococcus thermophilus C4。各菌株均能在葡萄糖中生长，Lactobacillus casei CM1生长速度最快，Lactobacillus acidophilusCM5生长速度最慢。

2.2.4 在同类碳源中不同菌株的生长迟滞期比较

迟滞期代表菌株开始生长的时间，预示在发酵剂中开始起作用的时间。从表2中可以看到，在乳糖中生长速率较大的两株嗜热链球菌C4和C1-2相比，C4的迟滞期较短，所以C4可能是在发酵过程中最早发挥作用的菌株。在葡萄糖中CM1的迟滞期短于C1-2，在半乳糖中CM1的迟滞期短于C4。

3 结论

结合菌株利用碳源的范围，在不同碳源中的生长速度及生长的迟滞期，对菌株间碳源间的互作关系进行预测：嗜热链球菌C4在乳糖中的迟滞期最短(1.30±0.02)，可能是发酵过程中最先发挥作用的菌株，其降解乳糖产生的葡萄糖和半乳糖供干酪乳杆菌CM1生长(2.84±0.16)，随后嗜热链球菌C1-2利用乳糖生长（2.89±0.22）。在此发酵剂菌株中C4菌株为发酵产酸的关键菌株，其快速产酸能力可促进产品的凝乳，其降解乳糖产生葡萄糖和半乳糖供其他菌株生长；干酪乳杆菌CM1快速利用半乳糖和葡萄糖的能力可进一步促进产品的凝乳；产酸较慢的嗜热链球菌C1-2是一株产黏的菌，能促进酸奶组织状态和良好质地的形成。本研究对菌株利用碳源能力的分析为复合发酵剂的开发提供了有效数据。

参考文献

[1] Hugenholtz J. Population dynamics of mixed starter cultures[J].Netherlands Milk and Dairy Journal,1986,40:129-140.

[2] Boucher DH, James S, et al. The ecology of mutualism[J].Annual Review of Ecology and Systematics,1982,13:315-347.

[3] Courting P, Rul F. Interactions between microorganisms in a simple ecosystem: yogurt bacteria as a study model [J]. Le Lait, 2004,84:1-2,125-134.

[4] Letort C, Nardi M, et al. Casein utilization by Streptococcus thermophiles results in a diauxic growth in milk[J].Appliedand Environmental Microbiology, 2002,68:3162-3165.

[5] Sieuwerts S, de Bok FAM, et al. Unravelingmicrobial interactions in food fermentations: from classical togenomics approaches[J].Applied and Environmental Microbiology, 2008,74:4997-5007.

[6] Kim JH, Shoemaker SP, et al. Relaxed Control of Sugar Utilization in Lactobacillus brevis[J].Microbiology, 2009, 155:1351-1359.

[7] Saeed A Hayek, Salam A Ibrahim. Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review[J]. Food and Nutrition Sciences, 2013,4:73-87.

[8] Tabasco R, Paarup T, et al. Selective enumeration and identification of mixed cultures of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. paracasei subsp. paracasei and Bifidobacterium lactis in fermented milk[J]. International Dairy Journal, 2007, 17:1107-1114.

[9] Haros M, Bielecka M, et al. Phytate- degrading activity in lactic acid bacteria[J]. Polish Journal of Food and Nutrition Sciences, 2008, 58:33-40.

[10] Barrangou R, Altermann E, et al. Functional and comparative genomic analyses of an operon involved in fructooligosaccharide utilization by Lactobacillus acidophilus[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003,100:8957-8962.

[11] Møretrø T, Hagen BF, et al. A New, Completely defined medium for meat lactobacilli[J]. Journal of Applied Microbiology, 1998, 85:715-722.

[12] Hébert EM, Raya RR, et al. Nutritional requirements of lactobacillus delbrueckii subsp. lactis in a chemically defined medium[J]. Currunt Microbiology, 2004, 49:341-345.

[13] Letorc C. Relation entre croissance et nutrition azotee de deux bacteries lactiques thermophiles: Streptococcus thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus[D]. Ph.D.Thesis, France:Universite de Poitiers, 2001.

[14] Sudun, Wulijideligen, et al. Interaction between lactic acid bacteria and yeasts in airag, an alcoholic fermented milk[J]. Animal Science Journal, 2013, 84:66-74.

The Analysis of Utilization of Carbohydrates in Milk and the Predition of Their Cross-feeding of Starter Strains

SU Dun1,2, LIU Song-ling2, MA Yu-xuan2, WANG Ya-nan2, GE Shao-yang2, REN Fa-zheng2, YANG Zi-biao3, MU Zhi-shen1
(1.Inner Mongolia Mengniu Dairy (Group) Co., Ltd, Hohhot, 011500; 2.College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing Higher Instititution Engineering Research Center of Animal Product, Beijing 100083; 3.Dali Vocational and Technical College of Agriculture and Forestry Dali 671000)

Fermented milk is of favorable flavour, rich nutrition, and special function and is becoming the most popular production. The starter, the strains in the starter and their cross-feeding is the most important influence of the quality and propoerty of the fermented milk. In this study, we focused on the cross-feeding of the five strains from a cultural milk starter. The five strains all can ultilize glucose, Streptococcus thermophilus C4 and Cl-2 can ultilize lactose, Lactobacillus casei CM1 and Streptococcus thermophilus C4 can ultilize galctose. The growth rate and lag time were analyzed. The lag time of C4 in lactose is the shortest (1.30±0.02), then is the CM1 in glucose and galactose, and the third is C1-2 in lactose. It is predicted that C4 is the key strain in the starter which is responsible for the acidifiction in the fermentation. The glucose and galactose from the degradation of lactose by C4 is the substract of CM1, which reinforce the acidifying rate. C1-2 is viscosity producing strain and help improve structre characterics.

Starter; Fermented milk; Streptococcus thermophilus; Lactobacillus casei

TS252.1

A

1004-4264（2017）04-0048-05

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.04.013

2016-12-05

云南省科技计划生物重大专项（奶业专项）（2014ZA001）；北京市教育委员会中央在京高校重大成果转化项目“益生菌生产关键技术科技成果转化”。

苏敦（1983-），女，博士，研究方向为乳品微生物。

母智深（1968-），男，研究员，博士，研究方向为乳品微生物。