桑葚花色苷的提取、纯化研究

□徐颖/广元市农业局

桑葚花色苷的提取、纯化研究

□徐颖/广元市农业局

桑葚又名桑枣、桑果，属于桑科落叶乔木桑树类的成熟果实，味甜多汁，风味独特，是备受人们喜爱的水果之一。桑葚中含有各种人体所需营养成分，比如维生素、氨基酸、矿物元素、黄酮类物质和多糖等，另外，桑葚中还含有非常丰富的桑葚红色素，属于花色苷类成分，目前桑葚红色素已经被列入国家食品添加剂食用卫生标准（GB 2760-2011）中，在48种天然色素中占有一席之位。天然色素是当今世界发展的潮流。因此，提取桑葚中的天然色素，并将其应用于食品加工等行业也是对桑葚资源开发利用的重大趋势之一。

花色苷易溶于极性溶剂中，因此常用的提取方法为溶剂萃取法，桑葚花色苷多采用酸性乙醇提取，但此方法容易使花色苷发生降解。而超声波可以产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用，一方面产热来促进溶质的溶出，另一面增加溶质与溶液间的接触，从而能缩短提取时间、提高提取率。因此，本试验重点研究超声波辅助萃取法来提取桑葚中的花色苷，分别对影响提取率的4个条件因素进行优化比较，包括时间、料液比、乙醇浓度和超声波功率，通过单因素和正交试验来确定提取桑葚花色苷的最佳条件。然后将得到的花色苷粗提物采用Amberlite XAD7HP型大孔吸附树脂进行分离纯化，以此来得到高纯度的花色苷纯化物。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑葚干，重庆广亚生态农业发展有限公司提供。

KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；4K-15台式冷冻离心机（德国Sigma公司）；DF8517超低温冰箱（韩国ilshin公司）；ALPHA1-4LSC真空冷冻干燥机（德国Chist公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 花色苷提取率的测定

总花色苷（以矢车菊花青素-3-葡萄糖苷计）含量用pH示差法进行测定：吸取1 mL提取液，分别用2种不同的缓冲液将其稀释到100 mL。第一种为pH=1.0的盐酸-氯化钾（0.025 mol/L）缓冲液，第二种为pH=4.5的醋酸-醋酸钠（0.4 mol/L）缓冲液。摇匀后静置15 min使其平衡后，分别测定其在520 nm和700 nm下的吸光度，以蒸馏水为空白。根据Wrolstad等人推导的公式计算花色苷提取率。

γ（mg/g）=（A×MW×DF）/（ε×L×SL）

A=（A520-A700）pH1.0-（A520-A700）pH4.5

式中：γ-花色苷提取率；

A-吸光度差值；

DF-稀释倍数；

MW-矢车菊花青素-3-葡萄糖苷的分子量（449.2）；

ε-矢车菊花青素-3-葡萄糖苷的消光系数（26 900）；

SL-提取工艺中的料液比；

L-标准光程（1 cm）。

1.2.2 花色苷提取试验

采用超声波辅助酸化乙醇萃取法，原料为干桑葚，将其打成粉末状，以供后续试验使用。称取一定量的桑葚粉，按一定浓度的酸化乙醇（0.1%HCl）、时间、超声波功率和料液比进行提取，将提取液冷冻离心（4℃，5 000 r/min，10 min），过滤，测定滤液吸光度，计算花色苷提取率，经单因素正交试验确定最佳提取条件。将提取滤液进行旋转蒸发（45℃），得到花色苷粗提物浓缩液，将其倒入培养皿中，放置于-80℃冰箱，冷冻2 h后放入真空冷冻干燥机将其冷冻干燥为桑葚花色苷粗提取物干粉。

1.2.2.1 单因素试验

1）不同时间对提取效果的影响。准确称取5份质量为5.00 g的桑葚粉，按料液比1∶15，加入到75%酸化乙醇溶液中，在超声波功率为160 W的条件下分别提取20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，离心、过滤之后测定花色苷提取率，通过比较提取率大小来确定较优水平。

2）不同乙醇浓度对提取效果的影响。准确称取5份质量为5.00 g的桑葚粉，按料液比1∶15，分别加入到浓度为45%、55%、65%、75%、85%的酸化乙醇溶液中，在超声波功率为160 W的条件下提取30 min，离心、过滤之后测定花色苷提取率，通过比较提取率大小来确定较优水平。

3）不同超声波功率对提取效果的影响。准确称取5份质量为5.00 g的桑葚粉，按料液比1∶15，加入到75%酸化乙醇溶液中，分别在超声波功率为100 W、120 W、140 W、160 W、180 W、200 W的条件下提取30 min，离心、过滤之后测定花色苷提取率，通过比较提取率大小来确定较优水平。

4）不同料液比对提取效果的影响。准确称取5份质量为5.00 g的桑葚粉，料液比按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，加入到浓度为75%的酸化乙醇溶液中，在超声波功率为160 W的条件下提取30 min，离心、过滤之后测定花色苷提取率，通过比较提取率大小来确定较优水平。

1.2.2.2 正交试验

在以上单因素试验的基础上，选取时间、料液比、乙醇浓度和超声波功率这4个因素中的3个较优水平，采用正交表L9（34）设计进行正交试验，以花色苷提取率为考察指标，进行方差分析，确定桑葚花色苷提取的最佳条件，并且对最佳条件进行验证。

1.2.3 花色苷分离纯化试验

通过提取试验得到的桑葚花色苷粗提物含较多杂质，其稳定性、色价等各方面性质较差，因此需要经过分离纯化以得到纯度较高的花色苷纯化物，国内大多使用大孔树脂对提取的花色苷进行纯化，本试验采用Amberlite XAD7HP型大孔吸附树脂对花色苷粗提物进行分离纯化。

花色苷纯化物得率=（桑葚花色苷纯化物粉末质量/桑葚干粉质量）×100%

1.2.3.1 大孔吸附树脂的预处理

先将树脂用蒸馏水冲洗5～6次，洗至上层蒸馏水澄清。过滤之后，用95%乙醇溶液浸泡24 h，使其充分溶胀，湿法上柱，然后接着用95%乙醇溶液洗脱，直至流出液加适量水不会出现白色浑浊现象为止，再用蒸馏水洗脱直到无乙醇味即可。

1.2.3.2 花色苷纯化物的制备

将提取工艺制得的桑葚花色苷粗提物粉末配制成10%水溶液，然后将其导入Amberlite XAD7HP型的大孔吸附树脂柱中，以一定的流速进样，树脂完全吸附花色苷后用上样液20倍体积的酸化水（0.01%HCl）冲洗，以除去花色苷溶液中的可溶性杂质，再用酸化乙醇（0.1%HCl、80%乙醇）溶液洗脱，当从柱中流出的液体不透光时便用烧杯接入，直到液体开始透光之后停止。将此溶液进行旋转蒸发（45℃），得到的浓缩液放置于-80℃冰箱，冷冻2 h后放入真空冷冻干燥机将其冷冻干燥为桑葚花色苷纯化物干粉。

2 试验结果与分析

2.1 花色苷提取试验结果

2.1.1 时间对提取率的影响

在固定料液比1∶15，酸化乙醇浓度75%，超声波功率160 W的条件下，提取不同时间后的花色苷提取率结果如图1所示。随着时间的延长花色苷提取率逐渐增大，并在40 min时达到最大，此后随着时间的延长花色苷提取率开始下降，说明当超生波提取时间过长时会对花色苷提取造成损失。因此，选择超声波的提取时间为40 min。

2.1.2 乙醇浓度对提取率的影响

在固定料液比1∶15，超声波功率160 W，分别在不同浓度酸化乙醇的条件下提取30 min后花色苷提取率结果如图2所示。随着酸化乙醇浓度的升高花色苷提取率逐渐增大，并在75%时达到最大，但此后随着酸化乙醇浓度的升高花色苷提取率反而开始下降，可能原因是高浓度的乙醇破坏了花色苷的结构。因此，选择酸化乙醇的浓度为75%。

2.1.3 超声波功率对提取率的影响

在固定料液比1∶15，酸化乙醇浓度75%，分别在不同功率超声波的条件下提取30 min后花色苷提取率结果如图3所示。随着超声波功率的增大花色苷提取率逐渐增大，并在160 W时达到最大，此后随着超声波功率的增大花色苷提取率开始下降，说明当超生波功率过大时会对花色苷提取造成损失。可能原因是大功率的超声波会使提取过程中体系的温度迅速上升，而高温会破坏花色苷的结构。另一方面在实际生产中，超声波功率过大会使生产成本增加，这也不符合经济性原则。因此，综合各方面的因素考虑，选择超声波功率为160 W。

图1时间对提取率的影响

图2乙醇浓度对提取率的影响

图3超声波功率对提取率的影响

2.1.4 料液比对提取率的影响

在固定酸化乙醇浓度为75%，超声波功率160 W，分别在不同料液比条件下提取30 min，花色苷提取率结果如图4所示。随着料液比的减小花色苷的提取率逐渐增大，可能原因是当料液比越小，乙醇溶液与桑葚粉的接触面积便越大，因而使得更容易浸提出花色苷成分。但当料液比低于1∶15时，料液比再减小对花色苷提取率的增加并没有起到显著作用，可能是在此条件下对花色苷的提取作用已经接近极限，所以再增加溶剂的量也不会使提取率有明显提高。因此，从节约成本等方面综合考虑，选择料液比为1∶15。

2.1.5 正交试验结果

根据以上单因素试验的结果，确定各因素水平的选择范围，设计四因素三水平正交试验方案，因素与水平设计如表1，正交试验结果如表2所示。对试验结果进行数据分析，由表中极差值可判断各种因素对花色苷提取效果的影响大小顺序为：酸化乙醇浓度（%）＞料液比＞时间（min）＞超声波功率（W），最优组合为A2B3C2D2，即超声波功率160 W，料液比1∶20，时间40 min，酸化乙醇浓度75%。进行验证试验，得出结果花色苷提取率为15.129 2 mg/g，的确大于正交试验中得出的其他数值，由此可以判断A2B3C2D2确实是最佳的提取条件。

2.2 花色苷纯化物制备结果

在花色苷提取单因素和正交试验基础上，确定最佳提取条件，准确称取质量为70.00 g的桑葚粉，按料液比1∶20，加入到75%酸化乙醇溶液中，在超声波功率为160 W的条件下分别提取40 min后，取出离心、过滤，将滤液进行旋转蒸发，制得花色苷粗提物浓缩液。得到的浓缩液放置于-80℃冰箱，冷冻2 h后放入真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，最后得到桑葚花色苷粗提物干粉，用pH示差法测得此粗提物的花色苷含量为3.14%。

将制得的桑葚花色苷粗提物干粉按照1.2.3的步骤进行分离纯化，最后制得花色苷纯化物2.107 3 g，测得其花色苷含量为35.32%，计算得花色苷纯化物得率即产品获得率为3.01%。

图4料液比对提取率的影响

表1正交试验因素与水平表

表2正交实验结果

3 结论

试验采用超声波辅助萃取法来提取桑葚中的花色苷，通过单因素和正交试验确定出了最佳的提取条件，即超声波功率160 W，料液比1∶20，时间40 min，酸化乙醇浓度75%。而纯化工艺利用的是Amberlite XAD7HP型大孔吸附树脂对花色苷的吸附作用，使得超声波辅助萃取法制得的花色苷粗提物从花色苷含量为3.14%上升至35.32%，从而分离出纯度较高的花色苷纯化物。