两株希木龙假丝酵母14α-去甲基化酶基因(ERG11)的克隆及其功能初步验证

张浩，王千，刘伟

北京大学第一医院皮肤性病科，北京大学真菌和真菌病研究中心，皮肤病分子诊断北京市重点实验室，北京 100034

·论著·

两株希木龙假丝酵母14α-去甲基化酶基因(ERG11)的克隆及其功能初步验证

张浩，王千，刘伟

北京大学第一医院皮肤性病科，北京大学真菌和真菌病研究中心，皮肤病分子诊断北京市重点实验室，北京 100034

为探讨希木龙假丝酵母(假丝酵母又称念珠菌)的耐药机制，首先克隆出两株希木龙念珠菌ERG11基因，初步验证其功能，从而为后续研究奠定基础。从美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)基因数据库中获取白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌Erg11蛋白的保守序列，设计简并引物，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增获得希木龙念珠菌ERG11 cDNA部分片段；用快速cDNA末端扩增法(rapid amplification of cDNA ends，RACE)分别扩增其5′和3′端，获得完整的ERG11编码序列(coding sequence，CDS)；将CDS克隆到pYES2表达载体中，在尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母中过表达ERG11；用微量液基稀释法检测转化后的酿酒酵母对氟康唑的敏感性，初步验证其功能。结果显示，简并PCR扩增获得预期708 bp片段，5′RACE和3′RACE分别获得385 bp和1 336 bp片段，经纯化、克隆、测序、比对分析，获得两株菌的ERG11 CDS；比对其编码的蛋白，与其他念珠菌的Erg11蛋白高度同源；分别检测克隆了这两株希木龙念珠菌ERG11 CDS表达载体的酿酒酵母对氟康唑的敏感性，发现过表达ERG11明显降低其对氟康唑的敏感性。结果提示，简并PCR联合RACE能准确有效地克隆出希木龙念珠菌ERG11基因，用pYES2酿酒酵母表达系统能初步验证其功能。

希木龙假丝酵母；简并聚合酶链反应；快速cDNA末端扩增法

近年来，希木龙假丝酵母(Candidahaemulonii，C.haemulonii；假丝酵母又称念珠菌)感染所致真菌性疾病的发病率逐渐增高，特别是新生儿感染[1-4]。希木龙念珠菌作为机会性致病菌，主要引起免疫低下或受损者发生感染[5]，所致疾病包括甲癣、导管相关真菌血症等[6-7]。希木龙念珠菌对多种抗菌药物耐药，临床上治疗其引起的侵入性念珠菌病的效果较差[7-9]，因此研究其耐药机制具有重要临床意义。念珠菌对氟康唑的耐药机制主要包括靶酶14α-去甲基化酶基因(ERG11)突变或过表达、外排泵过表达及细胞应激反应异常。其中，ERG11突变或过表达是最常见的原因[10-11]。研究希木龙念珠菌中氟康唑靶酶的差异，首先要克隆出希木龙念珠菌ERG11基因。鉴于希木龙念珠菌基因组序列未知，本研究采用简并聚合酶链反应(degenerate polymerase chain reaction，degenerate PCR)及快速cDNA末端扩增法(rapid amplification of cDNA ends，RACE)，成功克隆出希木龙念珠菌ERG11基因，并在pYES2酿酒酵母表达系统中初步验证其功能[12-15]。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

两株希木龙念珠菌临床分离株编号为 BMU05228(Candidahaemulonii)和BMU05314(Candidaduobushaemulonii)，分属两个群。

1.2 主要数据库和软件

主要数据库和软件有：美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)数据库(http://www.ncbi.nih.nlm.gov)、BlockMaker软件(http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html)、共有序列简并杂合寡核苷酸引物(consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers，CODEHOP)软件(http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html)。

1.3 试剂

TRIzol 购自Thermo Fisher公司，PFUDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司，cDNA扩增试剂盒购自Thermo Fisher公司，5′RACE和3′RACE试剂盒购自Clontech公司，酵母基因组提取试剂盒购自Bioflux公司，pYES2质粒和酿酒酵母表达系统购自Thermo Fisher公司。

1.4 菌株DNA和RNA提取及cDNA生成

将两株菌分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)斜面培养基上复苏，30 ℃培养48 h，转接于酵母膏胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YPD)液体培养基中，30 ℃，200 r/min，培养24 h，离心收集孢子。一部分菌用酵母基因组提取试剂盒提取基因组DNA，另一部分经液氮研磨后用TRIzol法提取总RNA，然后用cDNA扩增试剂盒反转录获得cDNA。

1.5 简并PCR扩增获得中间段cDNA序列

在NCBI数据库中分别选取CandidaalbicansErg11 protein(GenBank：ACT21069.2和XP_716761.1)、CandidaparapsilosisErg11 protein(GenBank：ACT67904.1)、CandidatropicalisErg11 protein(GenBank：AAX39316.1和AAX39313.1)、CandidaglabrataErg11 protein (GenBank：AAX39317.1和ACI24047.1)序列。经BlockMaker和CODEHOP在线软件处理获得分数较高(>75)的引物(表1)，进行简并PCR。反应体系：cDNA 3.0 μL、2×PFU mix、上下游引物各1 μL，加水至25 μL。反应条件为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30循环，且每一个循环退化温度上升0.3 ℃； 72 ℃延伸10 min。PCR产物经纯化、克隆、测序、比对分析，获得中间段目的片段。

表1 本研究中使用的引物

Tab.1 Primers used in this study

PrimerSequence(5'-3')DegenerateprimersF:CCCCATGGTGTTCTACTGGATHCCNTGGR:CGATCAGCAGGTTGGCGATYTCYTGRTC5'RACEBMU05228GSP1:GCCTCGGCAGAAACGTCAGCGAGCTTGSP2:TTCTGCCGAGGCCGCTTACTCGCATT3'RACEBMU05314GSP1:GGGCGTAAGCTGCCTCGGCGGAAACGSP2:CGCCGAGGCAGCTTACGCCCACTTGERG11CDSBMU05228F:ATGGGCTATCTCGTTGATCTTR:TTAGTACACGCATGTCTCCCTBMU05314F:ATGACCTTGAAGGATCATCTTGR:TTAGTAAACACAAGTCTCTCTCTTC

1.6 RACE法获得ERG11 cDNA全长

根据上述获得的目的片段序列，设计5′RACE和3′RACE所需GSP1和GSP2引物(表1)。按Clontech RACE试剂盒说明书进行5′RACE和3′RACE，分别获得ERG11 cDNA 5′端和3′端片段。经纯化、克隆和测序，获得片段序列。将上述3种方法获得的3段序列进行拼接，得ERG11 cDNA全长序列。

1.7ERG11编码序列(coding sequence，CDS)分析

根据上述获得的ERG11 cDNA全长序列，于头尾设计一对引物(表1)，以希木龙念珠菌基因组为模板，扩增ERG11。经克隆测序分析，获得ERG11 CDS。

1.8 pYES2表达载体的构建

根据ERG11 CDS头尾序列分别设计含有KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物，PCR扩增，回收纯化PCR产物。用KpnⅠ和XbaⅠ限制性内切酶酶切pYES2质粒，使PCR产物与质粒酶切产物在T4连接酶作用下进行连接，获得含有BMU05228和BMU05314ERG11 CDS的质粒，命名为p28ERG和p14ERG。

1.9 质粒转化和菌株筛选

根据Thermo Fisher公司pYES2酿酒酵母表达系统说明书，用醋酸锂转化法将p28ERG和p14ERG分别转入尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母(INVSC1)中，涂布于SC-U培养基。待菌落长出后进行鉴定。挑取菌落，用T7引物进行PCR，测序鉴定PCR产物。

1.10 氟康唑敏感性测定

根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M27-A3方案，测定转化后的INVSC1对氟康唑的敏感性。

2 结果

2.1 简并PCR结果

PCR产物于预期708 bp处出现目的条带，经切胶纯化、克隆、测序、分析，并与其他酵母的ERG11 序列进行比对，确证该片段为希木龙念珠菌ERG11 cDNA片段。

2.2 5′RACE和3′RACE结果

BMU05228和BMU05314ERG11 cDNA经5′RACE和3′RACE分别获得385 bp和1 336 bp产物，经切胶纯化、克隆、测序、比对分析，确证这两段序列分别为ERG11 cDNA 5′端和3′端序列(图1)。

2.3ERG11 CDS分析

以两株菌ERG11 cDNA为模,分别获得3段序列(5′端、3′端和中间段)，将这3段序列进行比对拼接，获得两株菌的ERG11 cDNA全长序列。用cDNA头尾引物，以两株菌基因组DNA为模板，PCR扩增，获得ERG11基因。测序、比对分析后得知序列中无内含子，所得序列即为ERG11 CDS。BMU05228ERG11 CDS全长1 566 bp，编码521个氨基酸。而BMU05314ERG11 CDS全长1 575 bp， 编码525个氨基酸。将其蛋白序列与其他念珠菌的Erg11蛋白序列进行比对，发现序列之间具有很高的同源性，证实所得序列为希木龙念珠菌ERG11基因序列。

A: BMU05228. B: BMU05314. M, DNA marker.

图1 简并PCR、5′RACE和3′RACE PCR产物电泳图Fig.1 The electrophoretogram of the products from degenerate PCR, 5′RACE and 3′RACE PCR

2.4 p28ERG和p14ERG转化后的INVSC1鉴定

挑取SC-U平板上的菌落，用T7引物进行菌落PCR，于1 700 bp处出现阳性条带菌落，为转化成功的菌落。将PCR产物进行测序、比对分析，提示为ERG11。

2.5 氟康唑敏感性检测

采用CSLI M27-A3方案，检测转化p28ERG和p14ERG质粒后的INVSC1对氟康唑的敏感性。结果显示(表2)，转化p28ERG和p14ERG质粒后，INVSC1对氟康唑的敏感性明显降低。这一方面表明表达载体能在酿酒酵母中使插入的ERG11基因过度表达，并导致其对氟康唑的敏感性明显下降；另一方面初步验证了RACE法获得的希木龙念珠菌ERG11基因的功能，即作为氟康唑的靶酶。

表2 酿酒酵母转化pYES2-ERG11表达载体后对氟康唑的耐药性

Tab.2 The susceptibility ofSaccharomycescerevisiaeto fluconazole after transforming with pYES2-ERG11

MIC50offluconazole(μg/mL)INVSC12pYES2vector4p28ERG1132p14ERG1164

3 讨论

研究希木龙念珠菌对氟康唑的耐药机制，首先要关注氟康唑的靶酶Erg11蛋白的突变或过表达，但其基因组序列未知，因此克隆其基因序列并验证其功能是迄需解决的问题。针对这一问题，最常用的方法是简并PCR联合RACE法[13-15]。

简并PCR是根据其他已知同源基因序列扩增未知基因片段。本研究利用其他念珠菌Erg11蛋白的保守序列设计简并引物，包括白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌，然后以cDNA为模板进行简并PCR，最后成功获得两株希木龙念珠菌ERG11 cDNA的中间片段。在进行简并PCR过程中，为有效扩增出目的片段并减少非特异性扩增，退火温度的设置尤其重要。本研究中，简并PCR的退火温度以低于引物较低Tm值5 ℃开始，每一个循环退火温度上升0.3 ℃，进行30个循环。以此条件进行简并PCR能有效获得目的条带，并减少非特异性扩增。

目前，5′RACE和3′RACE法很成熟，有多种试剂盒选择。本研究中的Clontech RACE试剂盒使用方法简单，效率较高，但获得的5′端序列从翻译起始密码子ATG开始，因此不能确定ERG11 mRNA的5′端是否含有5′非翻译区(5′-untranslated region，5′UTR)，3′RACE也不能确定是否含有3′UTR。

念珠菌Erg11蛋白作为氟康唑的靶酶，其突变和过表达均能导致念珠菌对氟康唑的敏感性减低，可用于初步鉴定克隆出的基因是否为ERG11。本研究将ERG11克隆到pYES2载体中，并转化进尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母中，使其在酿酒酵母中过表达，药敏结果显示转化后的酿酒酵母对氟康唑的敏感性明显降低。这一方法能较快速准确地对克隆出的基因功能进行初步验证。为进一步验证克隆出的ERG11功能，可在对氟康唑敏感的希木龙念珠菌中过表达ERG11，或在对氟康唑耐药的希木龙念珠菌中敲除ERG11后检测其对药物的敏感性。常见的希木龙念珠菌为多重耐药菌，其耐药机制可能不仅仅与ERG11基因相关，后续研究可进行全基因组测序和转录组测序，从中寻找耐药机制。

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. LIU Wei, E-mail: liuwei@bjmu.edu.cn

Cloning and functional identification of 14α-demethylase genes (ERG11) from two differentCandidahaemuloniistrains with degenerate PCR combined with RACE

ZHANG Hao, WANG Qian, LIU Wei

DepartmentofDermatologyandVenereology,PekingUniversityFirstHospital,ResearchCenterforMedicalMycology,BeijingKeyLaboratoryofMolecularDiagnosisonDermatoses,PekingUniversity,Beijing100034,China

ERG11 genes from two differentCandidahaemuloniistrains were cloned and their functions were verified for studying the mechanism of antifungal resistance. To obtainERG11 gene, degenerate primers were designed according to the conserved sequences in Erg11 protein from the other four types ofCandidaspp. PartialERG11 cDNA was amplified by degenerate polymerase chain reaction (PCR). And 5′ cDNA and 3′ cDNA were amplified by rapid amplification of cDNA ends (RACE) method. The full-lengthERG11 coding sequences (CDSs) were obtained after aligning and splicing. Furthermore,ERG11 CDSs were cloned into pYES2 and transformed intoSaccharomycescerevisiae(S.cerevisiae) which is auxotrophic for uracil. The susceptibility of yeasts to fluconazole was assayed following Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3. The results showed that the completeERG11 CDSs were obtained and identified through homologous alignment of Erg11 proteins with otherCandidaspp. Moreover, the susceptibility of yeasts to fluconazole was obviously reduced by overexpression of Erg11 proteins inS.cerevisiae. It is suggested thatERG11 genes can be effectively cloned by degenerate PCR combined with RACE and their functions could be preliminarily verified in pYES2 yeast expression system.

Candidahaemulonii; Degenerate polymerase chain reaction; Rapid amplification of cDNA ends

国家自然科学基金(81471925)

刘伟

2016-11-10)