体外诱导获取对利奈唑胺耐药的结核分枝杆菌菌株及其稳定性研究

胡明豪 王彬 付雷 徐建 陆宇



体外诱导获取对利奈唑胺耐药的结核分枝杆菌菌株及其稳定性研究

胡明豪 王彬 付雷 徐建 陆宇

目的 利用浓度2倍递增的方法体外诱导获得对利奈唑胺(linezolid，Lzd)耐药的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)菌株，考察其耐药稳定性及用于筛选新化合物的抗结核活性。方法 将MTB标准株H37Rv(ATCC27294)在Lzd浓度2倍递增的含药固体培养基上进行传代培养，逐步诱导菌株对Lzd耐药，运用微孔板阿尔玛蓝(microplate alamar blue assay，MABA)法测定部分抗结核药物对体外诱导Lzd耐药株的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，对体外诱导获得的Lzd耐药株测序鉴定rplC基因的突变情况。将诱导Lzd耐药菌株在无药固体培养基上连续传代培养10代以观察耐药稳定性变化，包括MIC变化和rplC基因突变情况。结果 MTB标准株诱导后得到7株单克隆MTB菌株，其对Lzd的MIC值范围是5.99～18.28 μg/ml，为诱导前(0.25 μg/ml)8倍以上，成功获得Lzd耐药株，且对Sutezolid(PNU-100480)同时发生交叉耐药，7株菌株均检测到rplC基因中T460C的突变。体外诱导Lzd耐药株在无药固体培养基上连续传代10代，MIC值有所下降(范围为4.71～7.47 μg/ml)，但均稳定在诱导前8倍以上。结论 通过体外诱导实验可以获得对2种恶唑烷酮类(Oxazolidinones)药物均耐药的MTB耐药菌株；rplC基因突变与MTB对恶唑烷酮类药物的耐药相关；MTB对恶唑烷酮类药物的耐药稳定性较强，较难复敏。

分枝杆菌，结核； 恶唑烷酮类； 体外研究； 抗药性，细菌； 连续传代

利奈唑胺(linezolid，Lzd)属于第五组抗结核药物[1]，具有良好的抗结核活性，且独特的作用机制使得它与传统抗结核药无交叉耐药性。已有研究提示，Lzd治疗耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)和广泛耐药结核病(extensively drug resistant tuberculosis，XDR-TB)取得了比较好的临床效果；但Lzd的主要不良反应(外周神经炎和骨髓抑制)和高昂的价格也限制了其在临床的广泛应用[2-4]。机体在长期或不合理用药的情况下，可能产生Lzd获得性耐药。目前，国内外有关Lzd耐药的相关研究报道较少，Lzd耐药诱导的研究尚缺。由此，笔者拟采用体外诱导耐药株的方法，获得耐Lzd的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)菌株，为进一步探讨Lzd发生耐药的规律，为干预Lzd耐药的发生、指导临床合理用药、克服不良反应(筛选活性优良的新化合物)等提供帮助。

材料和方法

1.菌株：MTB标准株H37Rv(ATCC27294)为北京市结核病胸部肿瘤研究所药物研究室保存菌株。

2.药物：异烟肼(INH，批号：SLBC3024V)、利福平(RFP，批号：080M1506V)、乙胺丁醇(EMB，批号：050M0034)、环丝氨酸(Cs，批号：021M1711V)均购自美国Sigma公司。莫西沙星(Mfx，批号：BXFZG31)购自德国Bayer公司。Lzd、PNU-100480、TBA-354为全球结核病药物研发联盟(TB Alliance)惠赠。氯苯吩嗪(clofazimine，CFZ；批号：20150328)、贝达喹啉(bedaquiline，TMC207；批号：20150317)、pretomanid(PA-824；批号：20150226)购自上海瀚香生物科技有限公司。卷曲霉素(Cm)购自中国生物制品检定所。新化合物(编号)：T1～T8等，属于恶唑烷酮-硝基咪唑类双功能结构的分子，由丹诺医药(苏州)有限公司提供。INH、EMB、Cm、Cs用灭菌蒸馏水溶解，其他药物用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，溶解后用0.22 μm 无菌滤器过滤，-80 ℃保存。

3.试剂：DMSO购自成都化学试剂厂。7H9、7H11培养基干粉及营养添加剂油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶(oleic acid albumin dextrose catalase，OADC)购自美国BD公司，应用液为含10% OADC的7H9液体培养基和7H11固体培养基。阿尔玛蓝(Alamar blue)购自英国AbD Serotec公司，4 ℃避光保存；Golden view购自北京博迈德生物技术有限公司；PCR试剂购自日本Takara公司。

4.仪器：多功能酶标仪购自瑞士Tecan公司，型号Infinite 200 PRO。台式高速离心机购自德国SIGMA公司，型号3K-15。恒温培养箱购自上海智城分析仪器制造有限公司，型号ZHWY-100B。紫外分析仪购自北京市六一仪器厂，型号WD-9403D。全自动数码凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司，型号Tanon-4200。0.22 μm无菌滤器购自美国Millipore公司。

5.Lzd对MTB的最小抑菌浓度(MIC)值测定：用DMSO溶解Lzd并配制成10 mg/ml浓度，分装保存于-80 ℃，使用时用DMSO稀释成所需浓度(DMSO终浓度小于1‰)。采用微孔板阿尔玛蓝(microplate alamar blue assay，MABA)二倍稀释法[5]进行Lzd的MIC值测定：96孔荧光板中每孔加入7H9液体培养基和H37Rv菌悬液[浓度是106菌落形成单位(CFU)/ml]各100 μl，Lzd的浓度分别是20、10、5、2.5、1.25、0.62、0.31、0.16 μg/ml，每板均设培养基和菌液生长对照孔。96孔荧光板置于37 ℃恒温箱孵育，6 d后向各孔内加入20 μl阿尔玛蓝和12.5 μl 20%的吐温80混合液，37 ℃恒温孵育24 h后，将酶标仪测试模式设置为激发波长530 nm，发射波长590 nm，以7H9液体培养基对照孔为背景进行荧光值校正，测定各孔的荧光值，MIC值定义为荧光值的抑制≥90%的最低药物浓度[6]。

6.体外诱导耐药实验：取本实验室-80 ℃保存的H37Rv，用7H9液体培养基复苏后，将其接种于7H11无药固体培养基上，待菌株培养2～3周至对数生长期，磨菌并用酶标仪测定其波长570 nm处的吸光度值(A570值；A570=0.1，相当于108CFU/ml)，并用7H9液体培养基将其稀释至104～105CFU/ml整数倍浓度，取200 μl稀释后的菌悬液涂布于含Lzd浓度为1/2的MIC值(0.15 μg/ml)或1倍MIC值(0.3 μg/ml)的7H11固体培养基及空白对照培养基，封膜后置于37 ℃ 5% CO2恒温培养箱孵育3～4周。从含Lzd浓度为1倍MIC值的固体培养基上挑取生长良好的单菌落，磨菌并稀释至104～105CFU/ml整数倍浓度后，接种于含Lzd浓度为2倍 MIC值(0.6 μg/ml)的7H11固体培养基及空白对照培养基上，封膜后恒温孵育3～4周，观察单菌落生长情况。从含Lzd浓度为2倍MIC值的固体培养基上挑取生长良好的单菌落，直接接种于含药浓度4倍MIC值的固体培养基及空白对照培养基上，封膜后恒温孵育3～4周，继续从含Lzd浓度为4倍MIC值的固体培养基上挑取单菌落直接接种于含药浓度为8倍MIC值的固体培养基及空白对照培养基上，恒温孵育3～4周，最终得到在含Lzd浓度为8倍MIC值的固体培养基上生长良好的单菌落。单菌落增菌后，对其MIC值进行测定，根据参考文献[7-8]，若诱导后Lzd的MIC值是诱导前的8倍以上，认为诱导耐药成功。

7.耐药相关基因rplC检测：刮取适量诱导耐药菌株(包括后续无药传代培养第10代菌株)于1.5 ml EP管，加入200 μl TE缓冲液，煮沸30 min，13 201×g离心10 min，取上清(模板)4 ℃保存备用。rplC基因PCR实验[9]：上游引物序列5′-TCCGCTCACCGCATAAGTACA-3′，下游引物序列5′-CGATGTTGGCCGGGACGT-3′(目的片段长度约933 bp)。反应体系包含2×PCR混合缓冲液12.5 μl，上下游引物各1 μl，模板3 μl，双蒸水补充至25 μl。扩增条件：98 ℃预变性5 min后进入循环；95 ℃ 30 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳出现较理想目的条带后送北京睿博兴科生物技术有限公司进行切胶纯化测序，测序结果用DNAman(V6.0.3.99)软件进行比对分析。

8.诱导耐药株的稳定性实验：诱导耐药株在无药固体培养基上连续传代培养10代，每隔3代测定Lzd、PNU-100480对各菌株的MIC值，观察其耐药的稳定性变化情况。

9.抗结核药物对诱导耐药株的敏感性实验：将Lzd耐药株接种于7H11固体培养基中培养至对数生长期(2～3周)，再用7H9液体培养基磨菌后制成菌悬液，向96孔荧光板中每孔加入菌液(浓度为106CFU/ml)100 μl。二倍稀释后，各药物的浓度范围如下：INH 0.039～5 μg/ml，RFP 0.039～5 μg/ml，EMB 0.156～20 μg/ml，Lzd 0.156～20 μg/ml，PA-824 0.039～5 μg/ml，Cfz 0.039～5 μg/ml，TMC207 0.039～5 μg/ml，Mfx 0.039～5 μg/ml，Cm 0.078～10 μg/ml，Cs 0.391～50 μg/ml，PNU-100480 0.039～5 μg/ml。测定11种抗结核药物(INH、RFP、EMB、Lzd、PA-824、Cfz、TMC207、Mfx、Cm、Cs、PNU-100480)的MIC值，比较诱导前后的MIC值。

10.诱导耐药株应用于新化合物的MIC实验：选取2株诱导成功的Lzd耐药菌株，进行新化合物的MIC实验，MIC测定方法如上述。

结 果

1．诱导耐药株的表型验证(MIC测定)：MABA法测定Lzd对H37Rv的MIC值为0.25 μg/ml。H37Rv经体外诱导实验得到7株Lzd耐药株，分别命名为L1、L2、L3、L4、L5、L8、L9，其对Lzd的 MIC值范围为5.99～18.28 μg/ml(表1)，可见诱导菌株对Lzd的MIC值是诱导前的8倍以上，并且对PNU-100480的MIC值也是诱导前的8倍以上，即本试验成功获得Lzd耐药株，这些耐药株同时对PNU-100480存在交叉耐药。

表1 各类体外诱导的Lzd耐药株对Lzd和

注 本实验体外诱导获得的Lzd耐药株分别命名为L1、L2、L3、L4、L5、L8、L9

2.体外诱导Lzd耐药株基因型验证(rplC基因检测)：TE煮沸法获得体外诱导Lzd耐药株(包括无药传代培养第10代菌株)基因组上清，经PCR扩增目的片段(rplC基因)，后进行琼脂糖凝胶电泳实验验证目的片段，将PCR产物进行测序。将测序结果与H37Rv的rplC基因序列比对后发现，7株体外诱导Lzd耐药株均出现rplC基因T460C突变。

3.体外诱导Lzd耐药株的稳定性观察：将体外诱导获得的Lzd耐药株在7H11无药固体培养基上连续传代培养10代，对第3、6、9代菌株进行MIC实验，各耐药株对Lzd和PNU-100480的MIC值见表2。

4.抗结核药物对Lzd耐药株的MIC值：测定11种抗结核药(INH、RFP、EMB、Lzd、PA-824、Cfz、TMC207、Mfx、Cm、Cs、PNU-100480)对各诱导耐药菌株的MIC值，具体见表3。

表2 各类体外诱导Lzd耐药菌株传代后对Lzd和PNU-100480的MIC值(μg/ml)

注 本实验体外诱导获得的Lzd耐药株分别命名为L1、L2、L3、L4、L5、L8、L9

表3 各类Lzd耐药菌株对抗结核药物的MIC值(μg/ml)

注 本实验体外诱导获得的Lzd耐药株分别命名为L1、L2、L3、L4、L5、L8、L9

表4 各类Lzd耐药菌株对新化合物的MIC值(μg/ml)

注 L1和L3为本实验体外诱导获得的Lzd耐药株

5.诱导耐药株应用于筛选新化合物(MIC实验)：参考Lzd对耐药株的MIC值，选择2株先诱导获得的Lzd耐药株(L1和L3)用于筛选抗结核活性良好的恶唑烷酮-硝基咪唑类新化合物。相比于Lzd，8个新化合物中的T6对L1和L3菌株抗菌活性相对较好，见表4。

讨 论

为提高MDR-TB和XDR-TB患者的临床治疗效果，Lzd被广泛用于治疗复杂的耐药结核病，而广泛的应用有可能导致其耐药趋势不断上升。临床研究报道，Lzd用于治疗MDR-TB有效，但是Lzd的耐药发生率在1.9%～10.8%之间[3,7,10]。2007年，Richter等[7]曾首次报道了4株Lzd耐药的MTB临床分离株。近来研究显示， Lzd的耐药与MTB菌株的rplC基因发生T460C突变明显相关[9,11-12]，本研究与其结果相符。但是关于Lzd对MTB耐药的机制至今仍未能完全阐明。由于Lzd临床耐药株较难获得，后续关于Lzd临床耐药株的研究也鲜有报道。笔者采用人工体外诱导耐药的方法，实现MTB菌株由敏感向耐药的转变，从而成功获得了体外诱导的Lzd耐药菌株，为探讨Lzd的耐药机制奠定了基础，同时对干预Lzd耐药的发生发展、克服不良反应(筛选活性优良的新化合物)具有重要意义。

与以往筛选耐药菌株的研究方法不同[8，13-14]，笔者从1/2 MIC浓度开始诱导，以Lzd浓度2倍递增的含药固体培养基对MTB的标准株进行体外诱导耐药，最终成功诱导出7株Lzd耐药的MTB菌株，这些菌株同时对PNU-100480也产生了交叉耐药。结果表明，在体外药物长期持续压力作用下，MTB可以产生对Lzd的获得性耐药，并发生对其他恶唑烷酮类(如PNU-100480)药物的交叉耐药，提示尽管MTB对Lzd耐药的自然突变率(2×10-8～5×10-9)相对较低[8]，但是耐药结核病的治疗仍需谨慎使用Lzd，避免获得性耐药和交叉耐药的产生。

本研究中诱导获得了7株Lzd耐药菌株，并分别对其表型(诱导后菌株对Lzd的MIC值是诱导前的8倍以上)和基因型(诱导后菌株均出现rplC基因T460C突变)进行了验证，同时也进一步确证了在药物长期选择压力下，大部分菌株中和获得性耐药密切相关的基因突变被选择出来，从而对恶唑烷酮类药物产生耐药。另外，这些Lzd耐药株耐药稳定性如何，是否会恢复突变为敏感株，还是一直持续耐药，目前尚未见相关报道。本研究将7株Lzd耐药株在固体培养基上连续无药传代10代，结果发现传代后菌株对2种恶唑烷酮类药物(Lzd、PNU-100480)的MIC值有波动，但MIC值仍为诱导前的8倍以上；并且对第10代菌株的rplC基因重新进行测序，结果仍为T460C突变。结果表明，MTB对恶唑烷酮类药物的耐药稳定性相对较强，较难复敏，其机制可能与MTB修复其适应性损失的代偿性进化密切相关[15]。此外，本次研究通过这些Lzd耐药株对其他抗结核药物的药物敏感性试验发现，除了恶唑烷酮类药物对耐药株产生交叉耐药外，EMB对部分Lzd耐药株(如L4和L8)的MIC值也明显增高，即EMB对这些菌株的敏感性降低。故EMB和恶唑烷酮类药物对这些耐药株是否存在交叉耐药，这还有待进一步研究。本研究选择了L1和L3耐药菌株，应用于新化合物的活性筛选，以期筛出活性优良并且对Lzd耐药株有效的恶唑烷酮-硝基咪唑类新化合物。

当然，本研究也存在一定局限。首先，本研究选择将H37Rv作为亲代菌株进行诱导，这样获得的体外诱导Lzd耐药株和Lzd临床耐药株可能存在一定差异，不能完全模拟临床中Lzd发生耐药的情况；但同时选择MTB临床敏感株作为亲代菌株进行诱导，不仅会增加工作量，而且由于MTB敏感株存在差异无法建立统一的诱导方法。其次，本研究获得的7株Lzd耐药株发生耐药的机制尚未完全明确，为了构建更加标准化的新化合物筛选模型，有必要对其耐药机制作进一步深入研究。

综上所述，本研究通过体外诱导试验成功获得了7株对Lzd耐药的MTB耐药菌株，这些耐药菌株均存在rplC基因的T460C突变，Lzd耐药菌株的获得为这类药物耐药机制的研究奠定了基础，达到指导临床合理应用恶唑烷酮类抗结核药物的目的。后期，笔者团队将继续开展这些MTB耐药菌株进行全基因组测序分析，以进一步探讨其对恶唑烷酮类抗结核药物的耐药机制，以及可能存在的EMB与恶唑烷酮类药物交叉耐药的机制。

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(本文编辑：李敬文)

Induction in vitro and stability ofMycobacteriumtuberculosisresistance to Linezolid

HUMing-hao,WANGBin,FULei,XUJian,LUYu.

DepartmentofPharmacology,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,Beijing101149,China

LUYu,Email:luyu4876@hotmail.com

Objective To gain strains ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) resistance with Linezolid (Lzd) utilizing twice increasing concentration inductioninvitro, investigating its stability of drug resistance and using which to screen for anti-tuberculosis (anti-TB) activity of new compounds. Methods MTB standard strains H37Rv (ATCC27294) were sub-cultured on solid culture medium containing twice increasing concentration of Lzd and induced the drug resistance to Lzd. The minimal inhibitory concentrations (MIC) of partial anti-TB drugs against induced drug resistant strainsinvitrowere detected through micro-plate alamar blue assay (MABA),rplCgenes of drug resistant strains obtained from inductioninvitrowere sequenced and identified for mutations. Induced drug resistant strains were continuously subcultured 10 generations on solid medium without drug to observe the resistance stability, including varieties of MIC andrplCgene mutations. Results Seven MTB monoclonal strains were obtained after induction with the MTB standard strains, the ranges of MIC values of Lzd against these strains were 5.99-18.28 μg/ml, which were eight times higher than before (0.25 μg/ml), drug resistant strains were successfully acquired and were resistant to Sutezolid (PNU-100480) simultaneously. T460C mutation in generplCwas detected in all 7 strains by sequencing. After 10 serially generations on solid culture medium without drug, MIC values of induced drug resistant strains were slightly declined (4.71-7.47 μg/ml), but all were stable for more than eight times than before. Conclusion MTB strains resistant to two kinds of Oxazolidinones antibiotic were obtained by inductioninvitro. Mutation ofrplCgene was related to Oxazolidinones antibiotic drug resistance of MTB. Drug resistant stability of MTB to Oxazolidinones antibiotic was strong, and it is difficult for MTB to resume susceptibility.

Mycobacteriumtuberculosis; Oxazolidinones;Invitro; Drug resistance, bacterial; Serial passage

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.04.017

“十二五”国家科技重大专项(2015ZX09102007-015)；北京市医院管理局“登峰”计划(DFL20151501)

101149 首都医科大学附属北京胸科医院耐药结核病研究北京市重点实验室 北京市结核病胸部肿瘤研究所药物研究室

陆宇，Email：luyu4876@hotmail.com

2016-12-05)