β-葡萄糖醛酸苷酶的重组表达及对黄芩苷的生物转化

周 琪，窦同意，丁乐乐，曲明佳，翁仔淼，吴大畅，侯 洁

(1. 大连医科大学 生物技术系， 辽宁 大连 116044；2. 中国科学院大连化学物理研究所 生物技术部 药用资源开发组， 辽宁 大连 116023)



论 著

β-葡萄糖醛酸苷酶的重组表达及对黄芩苷的生物转化

周 琪1，窦同意2，丁乐乐1，曲明佳1，翁仔淼1，吴大畅1，侯 洁1

(1. 大连医科大学 生物技术系， 辽宁 大连 116044；2. 中国科学院大连化学物理研究所 生物技术部 药用资源开发组， 辽宁 大连 116023)

目的 构建表达β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase，GUS)的重组菌株，得到高纯度β-葡萄糖醛酸酶，进而对黄芩苷进行生物转化获得黄芩素。方法 以E.coliK12基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增GUS基因，经酶切后连接到表达载体pET-28a中，获得重组表达载体pET28a-GUS，将重组载体转化到感受态细胞BL21(DE3)中，对所得基因工程菌进行培养条件和表达条件的优化；后经分离纯化后得到高纯度β-葡萄糖醛酸酶。以黄芩苷为底物进行酶法转化生产黄芩素，并对反应条件进行优化。结果 经测序，扩增的重组质粒目的基因序列与数据库中GUS基因序列一致。经IPTG(isopropy-β-D-thiogalactoside)诱导表达后， SDS-PAGE分析获得分子质量70 kDa的单一蛋白条带，工程菌最适培养条件为： 37 ℃、pH7.2、IPTG浓度0.6 μmol/L、诱导时间12 h。经过离心破碎、亲和层析、冻干后得到高纯度β-葡萄糖醛酸酶冻干粉。在该酶催化转化下，黄芩苷可转化为黄芩素，在40 ℃，pH 6.5，酶浓度60 μg/mL条件下，反应2.5 h，黄芩苷转化率可达72.5%。结论 成功构建了β-葡萄糖醛酸苷酶高表达菌株，并用于黄芩苷的定向水解制备黄芩素，为生物转化法生产黄芩素提供了新思路。

黄芩素；酶解；黄芩苷；β-葡萄糖醛酸苷酶

黄芩是传统中药，为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，具有抗菌，抗炎，抗病毒、抗肿瘤等作用[1-2]。黄芩中含有多种黄酮类化合物：黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等20余种成分[1-3]。其中，黄芩苷经口服进入肠道后，在肠道内经肠道菌水解为黄芩素被吸收入血，进而发挥作用[4-5]。临床药效实验证明，黄芩素比黄芩苷具有更强的生理活性[1,6]。目前，黄芩素的制备方法主要有以下3种：(1)从药材黄芩中分离提取；(2)水解黄芩苷制备黄芩素；(3)黄芩苷生物转化制备黄芩素[7-8]。在黄芩中，黄芩素含量低(一般在0.1%～0.5%之间)，直接提取分离收率很低。采用生物转化法生产黄芩素反应温和，易于控制，且无环境污染[9]。目前，国内已报道多种微生物用于黄芩素的生物制备，如黑曲霉[8]、人肠道菌[4]、白腐真菌[10]、米曲霉[11]等。由于黄芩苷为β-葡萄糖醛酸苷，苷元为黄芩素。在β-葡萄糖醛酸酶的催化作用下，黄芩苷可定向水解为黄芩素(图1)。因此，本实验提出酶法生物转化黄芩苷制备黄芩素，首先对β-葡萄糖醛酸苷酶基因进行克隆，并构建β-葡萄糖醛酸苷酶基因工程菌，通过发酵生产获得高纯度β-葡萄糖醛酸苷酶。在此基础上，建立β-葡萄糖醛酸苷酶催化体系，对黄芩苷进行生物转化制备黄芩素。

图1 黄芩苷生物转化过程Fig 1 Biotransformation of baicalin to baicalein

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌E.coliK12菌株、质粒载体pET-28a(+)、表达菌株感受态细胞JM109、BL21(DE3)、DNA Polymerase(Code No.R045A)、Nde I和Xho I限制性内切酶、DNA纯化试剂盒、5×In-Fusion HD Enzyme Premix均购自大连Takara公司。LB培养基琼脂、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、苯甲基磺酰氟(PMSF, Phenylmethanesulfonyl fluoride)、对硝基酚-β-葡萄糖醛酸苷(PNPG, p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)等均为国产分析纯。黄芩苷、黄芩素标准品购自成都普菲德生物技术有限公司，其他试剂为分析纯。

电泳仪(Bio-rad)，高速冷冻离心机(日本日立公司)，超声波细胞粉碎机(JY-96-Ⅱ宁波科生仪器厂)，PCR扩增仪(美国Applied Biosystems公司)，酶标仪(美国Thermo公司)，高效液相色谱仪(日本岛津公司)。

1.2 方 法

1.2.1 GUS基因PCR扩增

根据NCBI数据库查找E.coliK12 GUS基因序列，并根据基因序列设计引物对将大肠杆菌E.coliK12株菌体于50 μL 裂解液(TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164))中变性后离心取上清作为模版，扩增GUS基因，反应体系：DNA模板1 μL，2×PrimeSTAR Max Premix: 25 μL，P1 (20 pmol/μL) 1 μL，P2 (20 pmol/μL) 1 μL，ddH2O 20 μL。反应条件：94 ℃变性10 s，55 ℃复性15 s，72 ℃延伸10 s，35个循环。琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR产物。

引物： P1，5'-GGTGCCGCGCGGCAGCCATATG-TTACGTCCTGTAGAA-3',P2，5'-GGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCATTGTTTGCCTCC-3'，划线部分分别为Nde I和Xho I酶切位点。

1.2.2 构建重组质粒pET-28a-GUS

使用限制酶Nde I和Xho I对pET-28a(+)质粒进行酶切，反应体系如下：pET-28a(+)30 μL，10×H Buffer 5 μL，Nde I(10 U/μL)2.5 uL，Xho I(10 U/μL)2.5 μL，用ddH2O 补至总体积为50 μL，反应条件37 ℃，16 h。反应结束后取5 μL进行琼脂糖凝胶电泳。

将PCR产物和质粒进行连接反应制备重组表达载体pET-28a-GUS。反应体系：质粒 5 μL，PCR产物 (50 ng/μL ) 2 μL，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μL，用ddH2O将体积补至10 μL。连接反应条件：50 ℃，15 min。取连接产物1 μL热转化至E.coliCompetent Cell JM109(Code No.9052)中，涂布平板，37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆植菌，提取质粒后对其进行测序。

1.2.3 重组β-葡萄糖醛酸苷酶在大肠杆菌中的表达

经证实，质粒测序结果与参考序列完全一致后，取该质粒1 μL热转化至BL21(DE3)菌株中，涂布平板，37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆菌即为重组基因工程菌。在划线平板上选取阳性重组子放入5 mL LB液体培养基中，于37 ℃、120 r/min振荡培养过夜；按1%接种量转接到含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB培养基中，于37 ℃ 振荡培养至对数中期(OD600=0.6～0.8)时，加入IPTG至终浓度1 μmol/L，继续在37 ℃ 摇床振荡培养，诱导过夜，取出1 mL培养物，进行SDS-PAGE电泳分析及酶活力测定，选取酶活力及表达量最高的发酵条件进行后续实验。

1.2.4 β-葡萄糖醛酸酶的分离纯化

诱导培养结束后，取菌液于5000×g条件下离心15 min，弃上清，用PBS(pH 7.4)对沉淀进行重悬，加入PMSF(终浓度0.1 mmol/L)后于冰浴条件下超声破碎1 h。随后在20000×g、4 ℃条件下离心20 min，所得上清即含有目的蛋白。

使用Ni亲和层析柱对目的蛋白进行亲和层析，目的蛋白将随洗脱液一起流下。收集洗脱液于透析袋中，在水中透析2次，每次1～2 h，随后透析过夜即可，透析结束后透析袋中的蛋白会有所析出而使袋内液体呈现白色。收集透析后液体于离心管中，于-80 ℃冰箱放置过夜，随后至冻干机冷冻干燥，即得到高纯度β-葡萄糖醛酸酶冻干粉。

1.2.5 酶活力的测定

取10 μL PNPG(20 mmol/L)的PBS溶液，加入5 μL的酶溶液(10 μg/mL)，补充85 μL的PBS缓冲液，混匀后，在37 ℃条件下连续测定反应液在405 nm条件下的OD变化值，将在37 ℃，pH 7.4条件下，每分钟形成1 μmol pNP所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

1.2.6 黄芩苷转化分析方法的建立

参照文献[4]方法，测定转化液中黄芩苷水解产物黄芩素的含量。黄芩素的测定选用紫外吸光光度法。黄芩素结构中A环上有5,6,7三羟基结构，经测定黄芩素在紫外光区355 nm处有最大吸收，可通过其吸光度值来测定黄芩素生成量。以DMSO为溶剂，配制10 mmol/L 的黄芩素标准品溶液，用PBS分别稀释到20、40、60、80、100、120、160 和200 μmol/L，然后利用酶标仪在355 nm处检测其吸光度值，以吸光度对溶液浓度作黄芩素的标准曲线。

1.2.7 黄芩苷的生物转化

取200 μmol/L的黄芩苷溶液10 μL，加入10 μL的酶溶液，补充PBS缓冲液至100 μL，混匀后，在37℃下孵育一定时间后，向反应液中加入等体积的乙醇终止反应，反应体系经高速(20000×g)离心后取上清液用甲醇稀释后备用。以PBS为空白参照，测定离心上清液中黄芩素的吸光度值，根据黄芩素标准曲线，计算黄芩素的生成量。

1.2.8 反应条件的优化及确定

对以下6个因素：pH、接种比、培养时间、IPTG浓度、诱导时间和诱导温度(表1)，使用minitab 17 软件的实验设计部件对蛋白表达的最适条件进行实验设计和探究，得出因子回归方程。对不同诱导时间点的总酶活力、细菌密度和总蛋白浓度进行测定，探究诱导时间与总酶活力之间的关系。

按照表2中的试验因素和水平进行正交设计。选择L9(34)正交表作为实验方案(表3)进行条件优化。通过单因素实验确定正交试验的设计范围，优化黄芩甘苷转化反应条件，并进行正交试验。

表2 实验因素和水平Tab 2 Factors and levels in orthogonal array design for reaction optimization

表3 正交试验优化方案Tab 3 Orthogonal assay for reaction optimization

2 结 果

2.1 β-葡萄糖醛酸酶的重组表达

2.1.1 GUS基因的克隆与序列分析

琼脂糖凝胶电泳产物的分子量约为1.8 kb(图 2)，扩增目的基因序列与数据库中GUS基因(GenBank accession no: NC_000913.3)序列一致。

图2 GUS基因的PCR扩增结果Fig 2 PCR amplification of GUS gene

2.1.2 重组蛋白的诱导表达纯化

将重组菌株诱导表达前后的粗酶提取物(未经纯化的β-葡萄糖醛酸酶，含杂质)进行SDS-PAGE分析(图3a)，结果表明，与诱导前相比，经IPTG诱导后酶的表达量明显提高，且分布于细胞裂解液中(图3a，条带3)。经镍亲和色谱进一步纯化后得到蛋白，并进行SDS-PAGE分析，结果表明蛋白条带清晰单一，大小约为70 kDa，与目标蛋白相符，且纯度较高(图3b)。

a:1和2条带分别为未诱导细胞裂解液的上清和沉淀；3和4条带分别为诱导细胞裂解液的上清和沉淀。b:1～6条带为依次被洗脱下的后β-葡萄糖醛酸苷酶，7条带为纯化前的粗酶液。 M 均为蛋白marker 图3 裂解细胞和β-葡萄糖醛酸苷酶纯化酶的SDS-PAGE分析Fig 3 SDS-PAGE analyze of lysis cell and β-glucuronidase

2.1.3 诱导条件的优化

使用minitab 17软件对实验结果进行分析，条件1～8(表1)诱导的粗酶液总酶活力分别为471.4 U,2988 U,2177.1 U,2338.2 U,1256.3 U,1028.5 U,2948.5 U,1332 U，可知诱导时间是粗酶液总酶活力的显著性影响因素(图4a)。对实验结果进行回归分析，其因子回归方程如下：酶液活力(U)=-10393+1170A+104.2B+60.42C+594.6D+397.7E+300.1F-37.27A*F。其中A: pH; B: 接种比(mL); C: 培养时间 (h); D: IPTG 浓度 (μmol/L); E: 诱导时间 (h); F: 诱导温度 (℃)。

a：诱导时间对总酶活力的影响；b：IPTG浓度对总酶活力影响图4 诱导时间和IPTG浓度对总酶活力的影响Fig 4 Effect of induction time and IPTG concentration on the total enzyme activity

2.1.4 诱导表达条件的确定

当诱导时间为8 h时蛋白浓度达到最高，而诱导时间为12 h时总酶活力达到最高(图5a和b)，并且此时菌处于稳定期生长。因此，β-葡萄糖醛酸苷酶表达的最适条件为37 ℃、pH 7.2、0.6 μmol/L IPTG诱导12 h，在此条件下可以从1 L培养液中获得320 mg高纯度β-葡萄糖醛酸酶冻干粉纯酶。

a：诱导时间对总酶活力及细菌密度的影响，1为总酶活力，2为细菌密度；b：诱导时间对总酶活力及总蛋白浓度的影响，1为总酶活力，2为总蛋白浓度图5 诱导时间对蛋白表达及酶活力的影响Fig 5 Effect of the induction time on the protein expreesion and enzyme activity

2.2 黄芩苷的生物转化

2.2.1 黄芩苷转化分析方法的建立

对黄芩素和黄芩苷进行了吸收波长波谱扫描，黄芩素最大吸收峰出现在355 nm处(图6a)，而在相同情况下黄芩苷几乎没有吸收(图6b)。利用酶标仪检测355 nm处吸光度值，并以吸光度对溶液浓度作黄芩素的标准曲线，以进行反应体系中黄芩素的定量检测。

a：黄芩素和黄芩苷吸收波长波谱；b：黄芩素的标准曲线图6 黄芩素检测方法的建立Fig 6 Analysis method for the biotransformation

2.2.2 优化转化反应条件

正交试验结果可以看出，采用A3B3C3方案确定底物转化效率最高的反应条件。即在底物浓度为200 μmol/L，pH为6.5，酶浓度为60 μg/mL，反应温度为40 ℃时，经过2.5 h的孵育后黄芩苷的转化率最高，可达72.5%。见表4。

表4 黄芩苷转化条件的优化Tab 4 Condition optimization of the baicalin biotransformation to baicalein

3 讨 论

生物转化是一种高效和具有选择性的温和催化体系，酶及酶体系能将许多天然化合物转化为具有高生物活性物质。酶法生物转化黄芩苷制备黄芩素，可以获得更高效、更稳定的活性物质。黄芩苷结构中包含黄芩素苷元和1个分子葡萄糖醛酸，利用β-葡萄糖醛酸苷酶或产酶菌可对黄芩苷进行生物转化，得到黄芩素。β-葡萄糖醛酸苷酶是一种酸性水解酶，黑曲霉[8]、人肠道菌E.coli[4]、白腐真菌[10]、米曲霉均可作为野生型产酶菌，在发酵过程中将黄芩苷作为底物，对其催化水解。然而微生物发酵过程中，发酵液成分复杂，分离纯化困难，往往收率较低。通过对β-葡萄糖醛酸苷酶基因进行克隆制备得到高效产酶菌，进而获得高纯度酶粉，对黄芩苷进行酶催化水解，体系稳定且有利于黄芩素的分离提取。

鉴于β-葡萄糖醛酸苷酶在野生E.coli中高度表达，本研究通过对野生型E.coliK12中的β-葡萄糖醛酸苷酶基因进行克隆表达，使用pET-28a(+)作为质粒载体，最终将其转入BL21(DE3)宿主菌种，构建了基因工程菌。通过对比发酵后，野生型及工程菌中发酵液及破碎后菌体中的蛋白成分，发现野生型发酵液及裂解液中，蛋白成分均比较复杂，将为β-葡萄糖醛酸苷酶的纯化带来困难；而工程菌细胞裂解液中，β-葡萄糖醛酸苷酶为单一蛋白成分，有利于蛋白的进一步分离纯化。使用镍柱亲和层析对酶进行纯化，得到高纯度的冻干酶粉。以上结果说明通过基因克隆及诱导表达，获得了目标单酶。

工程菌发酵过程中，蛋白在诱导早期迅速积累并容易形成结构折叠错误、无功能的蛋白，而在诱导后期由于营养缺乏使菌体处于应激状态，结构折叠错误的蛋白进行重新折叠形成结构正确、功能完整的蛋白[12]。因此，为了探究诱导时间与总酶活力之间的关系，对不同诱导时间的总酶活力、细菌密度和总蛋白浓度进行了考察。通过实验发现产β-葡萄糖醛酸苷酶最适条件为37 ℃、pH 7.2、0.6 μmol//L IPTG诱导12 h，在此条件下可以从1 L培养液中获得320 mg纯酶。

将上述分离得到的β-葡萄糖醛酸苷酶用于黄芩苷的催化水解中，得到黄芩素。通过前期对单一条件实验确定正交试验的设计范围，采用A3B3C3方案对反应进行优化。最终确定底物浓度为200 μmol/L，pH为6.5，酶浓度为60 μg/mL，反应温度为40 ℃时，经过2.5 h的孵育后黄芩苷的转化率最高，可达72.5%。在3种因素中，温度对反应转化率影响最大，pH影响较小，而酶浓度的增加有利于转化率的提高。由于产物黄芩素本身对酶活性可能存在一定的抑制关系，延长反应时间并不能明显提高黄芩苷的转化率。在前期工作中，我们利用C18WAX固相萃取柱可以实现葡萄糖醛酸苷和苷元的快速分离，由于黄芩苷与黄芩素两者存在类似的结构差异[13]，因此，可以利用此方法进行分离纯化产物黄芩素，在后续研究中将体系中黄芩素的分离提纯进行优化，为黄芩素的生物制备提供条件。

本研究成功构建了表达β-葡萄糖醛酸苷酶的高产菌株，并得到高纯度β-葡萄糖醛酸苷酶，成功对黄芩苷进行催化水解获得黄芩素，并建立了利用β-葡萄糖醛酸苷酶对黄芩苷进行生物转化的方法。本方法成本低、对环境无污染，为生物转化黄芩苷制备黄芩素提供了新的思路。

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Bioconversion of baicalin to baicalein with recombinantβ-glucuronidase in Escherichia coli

ZHOU Qi1, DOU Tongyi2, DING Lele1, QU Mingjia1, WENG Zimiao1, WU Dachang1, HOU Jie1

(1.DepartmentofBiotechnology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China; 2.DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Dalian116023,China)

Objective To develop a novel and environmental-friendly method for bioconversion of baicalin to baicalein with recombinantβ-glucuronidase. Methods Theβ-glucuronidase encoding gene (GUS) was cloned fromEscherichiacoliwild strain K12, and transformed intoEscherichiacoliBL21 (DE3) with pET-28a (+) as the vector.β-Glucuronidase was overexpressed and then purified by Ni affinity chromatography in one step. The biotransformation of baicalin to baicalein was performed by the recombinantβ-glucuronidase, and the reaction conditions were optimization with orthogonal design. Results The protein was identified by SDS-PAGE with 70 kDa, and the maximum expression level could be achieved after induction for 12 h with 0.6 μmol/L IPTG, and 320 mg of purified enzyme, which could be obtained from one liter of bacterial culture. With the catalysis of the recombinantβ-glucuronidase, the baicalin was transformed to baicalein with 72.5% conversion ratio under optimized conditions. Conclusion A novel and environmental-friendly scheme for bioconversion of baicalin to baicalein with recombinantβ-glucuronidase was established. The method would hold great promise for further applications in both scientific research and biomedical industry.

baicalein;biosynthesis; baicalin;β-glucuronidase

10.11724/jdmu.2017.02.02

国家自然科学基金项目(81273590，81302793);精细化工国家重点实验室开放课题(KF1408)

周 琪(1988-)，女，助理实验师。E-mail: zhouqi@dmu.edu.cn

侯 洁，副教授。E-mail: houjie@nankai.edu.cn

Q819; R284.3

A

1671-7295(2017)02-0110-06

周琪，窦同意，丁乐乐，等.β-葡萄糖醛酸苷酶的重组表达及对黄芩苷的生物转化[J].大连医科大学学报，2017,39(2)：110-115.

2016-12-14；

2017-03-28)