脑胶质瘤EGFR、KRAS和Ki67蛋白的表达及临床意义

姜振富，李 梅，韦 鸿

(1.大连医科大学附属第二医院 神经外科，辽宁 大连 116027；2.大连医科大学附属第二医院 科研中心，辽宁 大连 116027；3.大连医科大学附属第一医院 病理科，辽宁 大连 116011)



论 著

脑胶质瘤EGFR、KRAS和Ki67蛋白的表达及临床意义

姜振富1，李 梅2，韦 鸿3

(1.大连医科大学附属第二医院 神经外科，辽宁 大连 116027；2.大连医科大学附属第二医院 科研中心，辽宁 大连 116027；3.大连医科大学附属第一医院 病理科，辽宁 大连 116011)

目的 研究胶质瘤表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、原癌基因KRAS蛋白以及与细胞增殖有关的核抗原Ki67蛋白的表达情况，为胶质瘤的靶向TKI治疗提供依据。方法 选取大连医科大学附属第二医院神经外科2001-2010年间手术切除的胶质瘤标本81例，按照患者临床病理特点及肿瘤WHO(World Health Organization)分级予以分组，用免疫组织化学方法检测组织的EGFR、KRAS和Ki67在胶质瘤中的表达情况，通过统计学分析这些蛋白表达与临床病理参数之间的关系及这些蛋白表达之间的相关性。结果 EGFR蛋白表达阳性率在年龄≤42岁与>42岁患者组分别为57.5%与80.5%，两者差异显著(P<0.05)；在低级别与高级别患者组分别为56.3%与77.6%，两者差异显著(P<0.05)。KRAS蛋白表达阳性率与患者性别，年龄及肿瘤分级无明显关系(P>0.05)。Ki67蛋白表达阳性率在低级别与高级别患者组间表达的差异具有显著性意义(P=0.001)。胶质瘤EGFR蛋白表达与KRAS及Ki67蛋白表达亦无显著相关关系(P>0.05)。胶质瘤Ki67蛋白表达与KRAS蛋白表达亦无显著相关关系(P>0.05)。结论 胶质瘤EGFR、KRAS蛋白的表达为相互独立的分子事件的发现提示胶质瘤发病机制的多样性；EGFR， Ki67蛋白的表达可用于辅助判定肿瘤的病理级别。

胶质瘤；EGFR；KRAS；Ki67

神经胶质瘤简称胶质瘤，是神经系统最常见的肿瘤，呈侵袭性生长，术后复发率高，且对放疗化疗不敏感。因此有效控制其生长及复发是该肿瘤治疗成功的关键。近年来，人们发现细胞内表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)信号转导通路异常激活可能是一部分胶质瘤的发病原因。目前，针对EGFR为作用靶点的分子靶向药表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)在治疗EGFR表达异常的非小细胞肺癌中取得了很大的成功[1-2]，那么EGFR-TKI是否也可以用于治疗EGFR表达异常的胶质瘤值得探讨。KRAS为EGFR转导通路中的下游信号蛋白，它异常表达常可出现于多种恶性肿瘤当中，同时也是肿瘤细胞产生TKI类药物耐药性的分子基础。Ki67抗原是存在于增殖细胞核的一种非组蛋白性核内蛋白。病理学上常用它的表达状况来反映肿瘤细胞的增殖状况。前期工作中我们发现，肿瘤WHO分级越高，Ki67蛋白阳性表达率越高。并且Ki67蛋白表达与KRAS蛋白表达存在着正相关发展的趋势，这提示EGFR信号转导通路在胶质瘤肿瘤细胞增殖过程中发挥重要作用[3]。本研究检测胶质瘤EGFR蛋白表达状况，并将其与胶质瘤KRAS和Ki67蛋白的表达情况相结合，分析这些蛋白表达与临床病理参数之间的关系及这些蛋白表达之间的相关关系，以进一步了解胶质瘤发病的分子机制，为胶质瘤的靶向TKI治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取大连医科大学附属第二医院神经外科2001-2010年间手术切除的胶质瘤标本81例，其中男性39例，女性42例；年龄3～75岁，其中年龄≤42岁者40例，>42岁者41例；WHO分级：Ⅰ级5例，Ⅱ级27例，Ⅲ级26例，Ⅳ级23例，将WHOⅠ～Ⅱ级定义为低级别组，WHOⅢ～Ⅳ级定义为高级别组，即低级别组32例，高级别组49例。依照上述患者临床病理特征及肿瘤WHO分级进行分组，通过免疫组织化学方法检测肿瘤组织中EGFR、KRAS和Ki67蛋白的表达情况。

1.2 实验方法

通过免疫组织化学方法检测肿瘤组织中EGFR、KRAS和Ki67蛋白的表达情况。EGFR、KRAS及Ki67蛋白。免疫组织化学SP法，操作步骤按照试剂盒说明进行，微波修复、DAB显色、冲洗、苏木复染、封片。取已知肺的阳性组织作阳性对照，以PBS替代一抗作阴性对照。

1.3 判断标准

EGFR、KRAS判断标准：在显微镜下随机选取5个高倍视野。阳性细胞百分比≤25%记为1分、25%～50%记为2分、51%～75%记为3分、>75%记为4分；细胞浆无色记为0分、淡黄色记为1分、棕黄色记为2分、棕褐色记为3分；最后二者相乘，乘积≤3分为阴性，>3分为阳性。

Ki67判断标准：在显微镜下随机选取5个高倍视野。阳性细胞百分比≤20%记为阴性，>20%记为阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行Chi-square检验和Spearman相关分析，结果均以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 神经胶质瘤组织EGFR、KRAS和Ki67蛋白的表达

EGFR蛋白表达阳性率为69.1%，其中男性与女性组分别为74.4%和64.3%，两者无显著性差异(P=0.327)；在年龄≤42岁与>42岁组分别为57.5%与80.5%，两者差异显著(P=0.025)；在低级别与高级别患者组分别为56.3%与77.6%，两者差异显著(P=0.042)。见表1、图1。

KRAS蛋白表达阳性率为53.1%，其与患者的性别、年龄及肿瘤WHO分级无明显关系(P>0.05)。见表1、图2。

Ki67蛋白表达阳性率为54.3%，其在低级别与高级别组间表达的差异具有显著性意义(P=0.001)。而与患者性别，年龄无明显关系(P>0.05)。见表1、图3。

2.2 神经胶质瘤组织的EGFR、KRAS和Ki67蛋白表达之间的相关性

经相关性检验，胶质瘤EGFR蛋白表达与KRAS蛋白表达无显著相关关系(r=0.282，P=0.106)；EGFR蛋白表达与Ki67蛋白表达无显著相关关系(r=0.192，P=0.110)。见表2。神经胶质瘤组织的Ki67蛋白表达与KRAS蛋白表达无显著相关关系(r=0.082，P=0.111)。见表3。

表1 神经胶质瘤组织EGFR、KRAS和Ki67蛋白的表达情况及与临床病理参数的关系

A：胶质瘤EGFR蛋白阴性表达(SP ×200)；B：胶质瘤EGFR蛋白阳性表达(SP ×200)；C：胶质瘤EGFR蛋白阳性表达(SP ×400)图1 胶质瘤EGFR蛋白表达情况Fig 1 Expression of EGFR protein in gliomas

A：胶质瘤KRAS蛋白阴性表达(SP ×200)；B：胶质瘤KRAS蛋白阳性表达(SP ×200)；C：胶质瘤KRAS蛋白阳性表达(SP ×400)图2 胶质瘤KRAS蛋白表达情况Fig 2 Expression of KRAS protein in gliomas

A：胶质瘤Ki67蛋白阴性表达(SP ×200)；B：胶质瘤Ki67蛋白阳性表达(SP ×200)；C：胶质瘤Ki67蛋白阳性表达(SP ×400)图3 胶质瘤Ki67蛋白表达情况Fig 3 Expression of Ki67 protein in gliomas

表2 神经胶质瘤组织的EGFR蛋白表达与KRAS、Ki67蛋白表达的相关性Tab 2 Correlations between the expressions of KRAS, Ki67 protein and that of EGFR protein in gliomas

表3 神经胶质瘤组织的Ki67蛋白表达与KRAS蛋白表达的相关性Tab 3 Correlations between the expressions of KRAS protein and that of Ki67 protein in gliomas

3 讨 论

神经胶质瘤是神经系统最常见的肿瘤，呈侵袭性生长，术后易复发，尤其是恶性胶质瘤，一般从确诊到死亡，平均生存期为1年。对于胶质瘤的治疗临床上首选手术切除，然而手术无法将一些生长在脑干或重要功能区的恶性肿瘤细胞全部清除，需辅以术后放化疗。由于放化疗会使组织细胞水肿，细胞体积增大，而颅内空间相对固定，容易形成脑疝，加速患者死亡。另外，由于神经系统中血脑屏障/血肿瘤屏障的存在，化疗药物很难达到肿瘤细胞所在的部位，因而化疗的效果不佳。针对每个患者的肿瘤特点，制定出特定的治疗方案，即肿瘤的个体化治疗，近年来逐渐被采用，已经成为肿瘤治疗的趋势。随着现代分子生物学和病理学的发展，对肿瘤发生的分子机制有了进一步的了解，因而提出了分子靶向治疗，即针对已经明确的致癌位点设计相应的治疗药物，其代表药物为EGFR-TKI,该药的作用机制为通过竞争性结合细胞表面表皮生长因子受体酪氨酸激酶催化域的结合位点，阻断EGFR活化，这样就阻断了其下游一系列转导通路的传导，从而抑制肿瘤细胞的增殖，起到抗肿瘤的作用[4]。

EGFR是原癌基因c-erB-1(HER-1)的表达产物，编码基因位于7号染色体短臂(7p11-13)，分子量约为170 kDa，属于表皮生长因子家族(erbB家族)中的一员，其在调控细胞生长、分化及增殖活性等方面起重要作用[5-6]。多位学者研究证明原发性恶性胶质瘤存在EGFR扩增(<40%)和EGFR过表达(>60%)[7-9]。本研究发现胶质瘤EGFR蛋白阳性表达率是69.1%，与文献报道的基本一致。这提示，EGFR异常活化与胶质瘤的发病关系密切，可能是神经胶质瘤发病的分子途径之一，那么EGFR-TKI类药物可能为治疗胶质瘤提供帮助。本研究还发现，在年龄>42岁的患者组EGFR表达显著高于年龄≤42岁的患者组，由于蛋白表达主要是由基因调控的，而文献报道在年龄<35岁的胶质瘤患者组织中没有发现EGFR的基因扩增，因此这可能是低年龄组EGFR蛋白表达较低的原因。另外，本研究发现在低级别患者组EGFR蛋白表达显著低于高级别患者组，与大多数文献报道一致。这一现象提示了EGFR可能与神经胶质瘤恶性增殖的生物学特性关系密切，为胶质瘤的病理分级提供了新的依据，同时也为胶质瘤的诊断和治疗提供了新的敏感指标。

KRAS基因编码了包含188个氨基酸残基，分子量为21.6 kDa的鸟苷酸结合蛋白，是鸟苷酸结合蛋白超家族成员之一，可以作为分子开关，调控EGFR-KRAS信号通路，调节细胞的增殖、分化和凋亡[10-11]。许多肿瘤的发生都与KRAS异常活化有关。文献报道，一些携带EGFR基因和蛋白异常表达的患者对EGFR-TKI类药物产生耐药，我们分析认为这是由于EGFR信号转导通路下游信号分子的基因或蛋白异常而引起的。KRAS作为其下游信号分子之一，其功能异常经常与肿瘤的TKI耐药有关。本研究发现，胶质瘤KRAS蛋白阳性表达率为53.1%，并且胶质瘤EGFR和KRAS蛋白表达是相互独立发生的分子事件，这提示KRAS蛋白的异常活化并不一定是由EGFR的持续激活而引起的。一般认为蛋白表达是由基因调控的，有报道在胶质瘤中KRAS基因突变仅是偶然发生，突变率很低[12-13]，我们推断在胶质瘤中KRAS蛋白的高表达也并不一定是由KRAS基因突变引起的，也可以是由基因扩增等其他原因所导致自发激活。因此，在对胶质瘤进行靶向TKI治疗之前，必须检测其下游的分子变化情况，以筛选出对TKI类药物治疗的受益人群。

Ki67抗原是由两条多肽链组成的存在于增殖细胞核的一种非组蛋白性核内蛋白，它的表达能用来有效的反映恶性肿瘤细胞的增殖效率，与恶性肿瘤的演进和预后密切相关[14-15]。我们前期工作发现Ki67蛋白表达与肿瘤的恶性程度密切相关，即随着Ki67蛋白的表达阳性率的增高，胶质瘤的WHO分级也会增高。同时，我们也发现Ki67蛋白表达状况与EGFR和KRAS蛋白表达状况均存在着正相关趋势。因此我们认为EGFR-KRAS信号转导通路的活化能够促进胶质瘤肿瘤细胞的生长、分化，与肿瘤恶性增殖密切相关，这为EGFR-TKI药物应用于胶质瘤的治疗提供了分子依据。

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医学术语使用规范

医学术语应全文统一，不要一义多词或一词多义。妇产科学、耳鼻咽喉科学、血液病学、呼吸病学、内分泌学、眼科学和外科学的名词已由医学名词审定委员会审定公布，应严格执行。其他尚未审定者，目前以下列两个主题词索引为准：(1)《医学主题词注释字顺表(1992年版)中文索引》(中国医学科学院医学信息研究所，1992)；(2)《中医药主题词表》(中国中医研究院图书情报研究所，1987)。在这两个主题词表中找不到者，则以人民卫生出版社出版的《英汉医学词汇》、化学工业出版社出版的《药名词汇》和科学出版社出版的各学科名词审定本为准。国内尚无统一译名的，参考以上词典慎重拟定，并在译名后加括号标注外文；在医学名词审定委员会正式公布后，应立即严格遵照执行。中文药物名称应使用其化学名，不用商品名。

Clinical significance of EGFR, KRAS and Ki67 protein expressions in gliomas

JIANG Zhenfu1, LI Mei2, WEI Hong3

(1.NeurosurgeryDepartment,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China; 2.LaboratoryCenter,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China; 3.DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China)

Objective To study the clinical significance of EGFR, KRAS and Ki67 expressions in glioma. Methods The postoperative glioma tissues were collected and divided into groups according to the clinicopathological agents and the classification of the WHO(World Health Organization). EGFR, KRAS and Ki67 expressions in glioma were detected by immunohistochemistry. Results EGFR protein expression frequency were 57.5% and 80.5% in the below and over 42-year-old age groups (P<0.05); 56.3% and 77.6% in the low grade and high grade groups (P<0.05). KRAS protein expression was not correlated to the genders, ages of patients and the grades of glioma (P>0.05). Ki67 protein expression frequency were 31.3% and 69.4% in the low grade and high grade groups (P<0.05). EGFR expression was not correlated to the expression of KRAS or Ki67(P>0.05). Ki67 expression was not correlated to KRAS expression (P>0.05). Conclusion In gliomas, EGFR and KRAS expressions were independent, which would suggest that many molecular mechanisms involved in the carcinogenesis and development of gliomas.

Gliomas; EGFR; KRAS; Ki67

10.11724/jdmu.2017.02.05

姜振富(1984-)，男，主治医师。E-mail：jzf-1001@163.com

韦 鸿，医师。E-mail：whong_1985@163.com

R739.41

A

1671-7295(2017)02-0127-05

姜振富，李梅，韦鸿.脑胶质瘤EGFR、KRAS和Ki67蛋白的表达及临床意义[J].大连医科大学学报，2017,39(2)：127-131.

2016-12-04;

2017-01-02)