岳东芳,张迈鹤,徐兆超,赵海东
(1.大连医科大学附属第二医院 乳腺外科,辽宁 大连 116027;2.中国科学院 大连化学物理研究所 生物技术研究部,辽宁 大连 116023; 3.大连医科大学,辽宁 大连 116044)
综 述
靶向乳腺癌的核酸适配体应用研究进展
岳东芳1,2,张迈鹤3,徐兆超2,赵海东1
(1.大连医科大学附属第二医院 乳腺外科,辽宁 大连 116027;2.中国科学院 大连化学物理研究所 生物技术研究部,辽宁 大连 116023; 3.大连医科大学,辽宁 大连 116044)
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,实现乳腺癌的早期诊断和早期治疗意义重大。核酸适配体是经过指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)筛选得到的寡核苷酸序列,在肿瘤诊断及治疗方面拥有良好的应用前景。本文对靶向乳腺癌的核酸适配体及适配体作为载体和探针在乳腺癌诊疗中的作用进行综述。
乳腺癌;核酸适配体;指数富集配体系统进化技术;诊断
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,占所有癌症种类的22.9%[1],也是导致女性癌症死亡的最主要原因,占所有女性癌症死亡患者的13.7%[2-3]。目前乳腺癌的诊断方法包括钼靶、超声、核磁和乳腺活检等,但因灵敏度不足使其在癌症早期很难检测出低水平的癌细胞。乳腺癌治疗的发展更加倾向于精准医疗,因此亟待寻找一种高选择性、高灵敏度和高特异性的乳腺癌诊疗技术。近年来核酸适配体(Aptamer)因其独特的生物学性能成为国内外学者研究的热点。本文对靶向乳腺癌的核酸适配体及适配体作为载体和探针在乳腺癌诊疗中的作用进行综述,为乳腺癌的诊疗提供一个全新的视角。
(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)筛选
1990年,Tuerk等[4]创建了寡核苷酸文库,并在此基础上提出了一种新的体外筛选和扩增单链DNA 或RNA片段的SELEX技术。他们利用SELEX技术筛选出了针对T4DNA聚合酶并具有良好选择性和结合性的RNA寡核苷酸,命名为“适配体”。随后,核酸适配体(Aptamers)作为一类新型的识别分子日益受到国内外生物化学、纳米材料学、生物医学等多学科研究者的广泛关注。核酸适配体是一段短的单链寡核苷酸序列(15~40个碱基),可以是单链DNA(ssDNA)或RNA[5]。适配体通过自身形成的三维空间结构(例如茎环、发夹、假结体和G-四链体等结构)和构象变化,在静电、范德华力和氢键等非共价结合力的作用下,高选择性、高亲和性地与靶分子(无机或有机小分子、肽、核酸、蛋白质等)结合。适配体与靶分子结合的过程类似于抗原-抗体的结合反应,因此适配体又被称为"化学抗体"。但它们由于分子量小及本身的生物学特性,表现出许多优于抗体的性能,在生物医学研究领域中具备诸多优势[6-8]:(1) 高组织渗透性。适配体本身的分子量小于抗体(15~40 kDa),会快速地穿过组织屏障达到目标靶向区域;(2)高亲和力。适配体与靶向分子结合时的解离常数Kd值可达到纳摩尔每升或皮摩尔每升;(3)强稳定性。即使是在高温情况下变性的适配体,也可以在温度降低的数分钟内复性,便于长期保存;(4)无免疫原性、无毒性。适配体是寡核苷酸,不会被人体的免疫系统识别,引起免疫反应;(5)易于合成和化学修饰,靶标广泛。正是由于这些优于抗体的特点,使得适配体被广泛应用于各种生物医学领域,诸如生物标志物的发现,临床诊断,活体成像及靶向治疗等方面。适配体容易被生物体内的核酸酶降解并清除体外,导致半衰期短。通过在磷酸骨架或是核糖2′-位,用氨基或氟基取代羟基,对2′-O-甲基嘌呤进行修饰,3′端加冒修饰都可以提高适配体对核酸降解酶的抵抗作用[9]。适配体与聚乙二醇或是胆固醇共轭连接,能够延长其在生物体内的半衰期,增加生物利用度[10]。
2.1 靶向乳腺癌核酸适配体(DNA或RNA)的研究进展
目前已用于临床或是处于临床前试验阶段的适配体有很多,虽然靶向乳腺癌的适配体在临床应用中还鲜见报道,但细胞和动物水平的实验研究取得了很大的进展[11]。已报道的靶向乳腺癌的适配体见表1。
表1 针对不同靶点的靶向乳腺癌的适配体
转移性乳腺癌依然占据乳腺癌患者的主体,近年来国内外的研究学者致力于探索新的途径提高转移性乳腺癌的诊断和药物治疗。Lee等[8]选择新的靶点骨膜蛋白,骨膜蛋白是细胞外质基质蛋白,在癌细胞中过表达,参与肿瘤的生长、转移和血管形成,最近的临床试验表明骨膜蛋白异常的表达与乳腺癌患者预后不良有很大的关联性。Lee筛选出了针对骨膜蛋白的DNA适配体PNDA-3。利用4T1原位乳腺癌小鼠模型证明,PNDA-3降低了原发肿瘤的生长和远处转移。E-选择蛋白是一种重要的粘附分子,也参与恶性肿瘤的转移,在乳腺癌等癌症中高表达。研究者们认为其可以作为诊断的标记物,辅助诊断及预后的评价。ESTA是针对E-选择蛋白筛选出来的新型DNA适配体,与E-选择蛋白有很高的结合力[12-13]。Kang等[11]首次报道了ESTA通过阻断E-选择蛋白与CD44的结合抑制肿瘤转移的进程。以上的研究通过选用新的靶点筛选适配体,缺乏针对乳腺癌的特异性,因此研究者们探索用乳腺癌细胞作为靶标筛选乳腺癌适配体。Li等[14]用SELEX技术针对乳腺癌MDA-MB-231细胞筛选出了一组新型的DNA适配体,其中LXL-1展现出了极高的富集,对转移性乳腺癌细胞具有很高的选择识别能力,可以作为分子成像探针用于对转移性乳腺癌的成像诊断(图1)。
近年来针对HER2的靶向药物治疗取得了突破进展,尤其是以曲妥珠单抗(赫赛汀)为代表的靶向药物在乳腺癌的治疗中意义重大。但绝大多数患者会产生获得性耐药。因此,亟需研发出针对HER2的新型靶向分子。HB5是通过SELEX靶向HER2筛选出来的DNA适配体,它可以与HER2的一个抗原表位多肽结合,Kd值为18.9 nmol/L,也可以与HER2的细胞外结构域ECD特异性结合,Kd值为316 nmol/L。HB5适配体展示了与HER2阳性的乳腺癌细胞很强的结合能力,可以作为研究乳腺癌诊断和治疗的新型靶向分子[15]。Chu等[16]为了探究HB5适配体是否可以代替抗HER2抗体对乳腺癌进行诊断。选用HB5适配体对214例乳腺癌标本进行染色,与传统的免疫组织化学染色方法(immunobistochemistry, IHC)对比,HB5适配体组的标本显示出了更强的膜染色效果,特别是对经传统IHC法染色模凌两可的标本。经过滚动循环放大增强(rolling circle amplification, RCA),HB5染色信号进一步增强。由此得出HB5核酸适配体可以代替抗体作为强有力的辅助工具,应用于对乳腺癌HER2水平的临床诊断(图2)。
a:核酸适配体HB5二级结构示意图;b-c:流式细胞仪测定FITC标记的适配体HB5和随机DNA序列对HER2阳性乳腺癌SKBR3细胞系和HER2阴性乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞系的结合能力,其中蓝线:SKBR3;红线:MDA-MB-231;黑线:MCF-7;d:滚动循环放大增强后HER2的表达;e:适配体HB5和抗-HER2抗体对乳腺癌组织标本的HER2进行免疫组织化学染色图2 核酸适配体HB5对乳腺癌HER2水平的临床诊断[16]Fig 2 Application of aptamer HB5 in the clinical diagnosis of breast cancer with HER2 expression[16]
随后佛罗里达大学Zhang等[27]通过细胞SELEX技术识别出一组新的乳腺癌核酸适配体:KMF2-1a,KMF3,KMF9b,可以在纳摩尔水平特异性识别乳腺癌MCF-10AT1细胞系。研究者通过荧光染料Cy5.5标记的链霉素亲和素与生物素连接的适配体KMF2-1a交联,新的复合体可以被递送到靶标乳腺癌细胞,由此认为KMF2-1a有作为乳腺癌诊断治疗中靶向药物传递的潜能。与此同时研究者们也在思考能否另外研发出新的靶向抑制剂,通过其他的分子机制途径抑制癌细胞的增殖。真核细胞蛋白质翻译起始因子elF4E是多条信号通路的中心汇集点,它的活性受到上游Mnks激酶磷酸化的调节,激活后的elF4E上调肿瘤相关蛋白表达,促进肿瘤的发生。受此启发,西班牙的García-Recio等[18]筛选出了4种靶向MNKs激酶的MNK1b DNA适配体。这种新型的MNK1b 适配体有效抑制了MDA-MB231乳腺癌细胞的增殖,为适配体的临床治疗应用建立了可能。
2.2 核酸适配体修饰分子探针在乳腺癌诊断中的应用
核酸适配体本身不具备可检测信号,需要在适配体上修饰一些荧光基团或纳米粒,例如FAM、FITC、Cy3、Cy5、Rhb6G、量子点(QDs)、金纳米粒(AuNPs) 、碳纳米管(CNTs)等。具有乳腺癌靶向能力的分子探针,可以在分子水平上识别乳腺癌细胞,有望成为乳腺癌诊断的有力工具。Kim等[28]制备出一种适配体探针SE15-8-QDs检测乳腺癌。通过靶向HER2筛选出一种微小RNA适配体(mini-aptamer SE15-8),通过链霉素亲和素-生物素反应,将生物素化的SE15-8适配体与亲和素化的量子点连接。与ErbB2阴性的癌细胞株相比,该适配体探针在ErbB2阳性的细胞株中呈现更高的荧光信号。由此得出SE15-8适配体修饰分子探针可以作为新型显像剂用于乳腺癌细胞的检测(图3)。
a:MDA-MB-231;b:KPL-4;c:MCF-7;d:A431图3 适配体探针SE15-8-QDs特异识别ErbB2表达细胞[28]Fig 3 Aptamer probe SE15-8-QDs specifically recognizes the ErbB2 expressed cells[28]
Cai等[7]研发出了一种新型荧光传感器,可以简便、敏感的对MCF-7乳腺癌细胞进行检测。这种适配体传感器由靶向识别乳腺癌的核酸适配体与光信号敏感的镧系元素铽(Ⅲ)组成,该传感器的检测限低至70 cells/mL,展现出极高的灵敏度。与传统的比较常见的有机染料和新兴纳米探针相比较,铽(III)和适配体构成的探针拥有更稳定的光学性能、良好的生物相容性以及简单的合成过程。他们认为这个适配体传感器为乳腺癌细胞和其他生物分子的早期筛查和临床诊断提供了一个有价值的研究方向。另外,韩国浦项市科技大学的Jo等[29]首次构建了双重适配体荧光探针,针对乳腺癌细胞上特异性靶点HER2和MUC1的两种适配体修饰二氧化硅纳米粒子。与单一的适配体体系相比,更加灵敏的双重适配体修饰的探针实现了对乳腺癌细胞的快速识别和准确判定,所以针对乳腺癌的诊断和动态监测,这种新颖的适配体探针可以增加诊断和结果的确定性。另一项研究在一段RNA单元腺嘌呤核苷酸的两侧分别连接荧光素和淬灭基团,通过指数富集配体系统进化合成的探针(SELEX)过程,筛选出新的RNA裂解脱氧核酶(RFDs)荧光探针AAI2-5。探针AAI2-5可以从常乳腺细胞和其他类型的肿瘤细胞中特异、灵敏的检测出MDA-MB-231细胞株,准确率达到90%[30](图4)。
a:铽(Ⅲ)修饰的新型荧光传感器原理示意图;b:适配体荧光探针AAI2-5反应机制示意图图4 适配体传感器的原理示意图[8,30]Fig 4 Principle diagram of aptamer sensors[8,30]
2.3 核酸适配体修饰药物分子用于乳腺癌治疗
抗肿瘤药物因缺乏肿瘤靶向性带来的毒副作用限制了其临床应用。此外,抗肿瘤药物需要在细胞内才发挥作用。因此,亟需建立靶向药物装载体系,提高抗肿瘤药物主动靶向癌细胞的能力,并通过介导内吞作用,提高抗癌药物摄取量,增加药效。目前已经被成功用到药物传递中的适配体是抗前列腺特异性膜抗原的适配体(anti-PSMA aptamer),可以用于传递化疗药物及其他细胞毒性药物(多花白树毒蛋白和核糖体毒素),例如利用量子点-阿霉素共轭物装载适配体靶向前列腺癌细胞[31]。
适配体可以通过直接或间接方式与药物结合,形成靶向药物递送系统。非共价直接嵌入方式是指将药物直接嵌入核酸适配体,利用适配体递送入细胞。这种方式无需对适配体和药物进行化学修饰,并且可以保持两者的生物学性能。Liu等[17]为了评估HB5适配体是否可以选择性的运载药物至HER2阳性的乳腺癌细胞,将阿霉素(doxorubicin, DOX)嵌入HB5适配体中形成适配体HB5-阿霉素复合体(Apt-DOX)。结果显示Apt-DOX复合体可以有效辨别出HER2阳性和阴性的乳腺癌细胞,并对阳性细胞产生杀伤作用,同时降低对阴性细胞的毒副作用,因此认为HB5适配体可以作为药物传递的靶向配体用于HER2阳性乳腺癌的靶向治疗。相类似的,台湾大学的Shieh等[21]和美国奥尔巴尼大学的Cohen等[22]都利用核酸适配体AS411,一种富含G的磷酸二酯寡核苷酸,在癌细胞内特异结合核仁蛋白,目前作为抗癌试剂用于Ⅱ期临床试验阶段,与卟啉化合物TMPyP4和卟啉光敏剂TMAP形成的嵌合物作为药物运载系统靶向MCF-7乳腺癌细胞。与正常细胞相比,适配体嵌合物在乳腺癌细胞中高度富集,并对乳腺癌细胞有更强的光损伤效果(图5)。之后,一些研究者成功构建出AS411适配体结合装载紫杉醇和阿霉素的纳米颗粒形成的复合物用于乳腺癌的靶向药物治疗[23-24]。
a:Apt-TMP复合体结构模型和反应机制示意图;b:流式细胞仪检测游离TMPyP4和Apt-TMP复合体在MCF-7细胞和M10细胞内孵育2h后细胞内分布情况;c:Apt-TMP复合体的光损伤作用对两种乳腺癌细胞的影响图5 核酸适配体AS411作为药物运载系统靶向MCF-7乳腺癌细胞[21-22]Fig 5 Aptamer AS411 as a drug delivery system targets MCF-7 breast cancer cells[21-22]
另外,还可以对适配体进行化学修饰,例如连接纳米粒子作为药物传递系统。最近,具有抗肿瘤性质的,可以在溶酶体内降解HER2的DNA适配体(HApt)被报道用于胃癌N87细胞系[19]。HApt适配体既具有靶向作用又兼具治疗能力,可以在细胞表面诱导HER2的交叉反应,将HER2从浆膜层运送到胞质空泡内被酶消化降解。HER2水平的下调通过改变细胞的增殖和下游信号通路诱发细胞的凋亡。美国西北大学的Lee等[20]构建了金纳米颗粒装载适配体HApt复合物作用于乳腺癌细胞。与游离的HApt适配体相比,内化的纳米结构提高了DNA适配体的靶向效率,加速了HER2的降解,为研发新的靶向药物运输系统提供了新的视角。Thiel等[32]选择和确定出了一连串的针对HER2的RNA适配体,可以特异性识别HER2阳性乳腺癌细胞并且有效地内化。此外他们将HER2适配体-Bcl-2-siRNA嵌合体作用在乳腺癌细胞中,发现该嵌合体选择性地在HER2阳性细胞内化,使得Bcl-2基因表达沉默,降低了Bcl-2基因的表达,使得HER2阳性细胞恢复了对低剂量化疗药(顺铂)的敏感性。MUC1蛋白是粘蛋白家族(Mucins)的一员,在癌细胞中表达的量是正常细胞表达的10倍以上。与肿瘤的发生发展密切相关。S2.2是靶向MUC1蛋白筛选出来的核酸适配体,可以与MUC1蛋白特异性结合。Wu等[6]将S2.2适配体装载到AU-Ag合金纳米粒子上,该复合体可以特异性靶向识别人乳腺癌MCF-7细胞,但对MUCI阴性的MCF-10A乳癌细胞,HepG2肝癌细胞无识别作用。此外,S2.2-AU-Ag 纳米复合物还以非常低的辐照功率密度(0.25 W/cm2)对MCF-7乳癌细胞进行光热疗,但对正常细胞和组织无杀伤作用。S2.2适配体连接到装载紫杉醇的纳米颗粒上(PTX-Apt-NPS)提高了药物靶向运输能力和对乳腺癌细胞的细胞毒作用(图6)[25]。适配体MUC1-5TR-1通过生物素与链霉亲和素的修饰与C1q蛋白结合形成的嵌合体可以在MCF-7乳腺癌细胞表面形成膜攻击复合物,诱导癌细胞死亡,起到免疫治疗作用[26]。
a:MUC1适配体S2.2-spacer结构示意图;b:乳化蒸发法制备PTX-Apt-NP复合体的过程;c:荧光共聚焦显微镜扫描图像检测乳腺癌MCF-7细胞摄取Apt-NPs (上行)或NPs(下行);d:PTX封装Apt-NPs体外药物释放;e:NP, PTX,PTX-NP,PTX-random-NP,PTX-Apt-NP细胞毒性测定,MCF-7(左)和HepG2细胞(右)。图6 S2.2适配体装载紫杉醇纳米颗粒对乳腺癌细胞的细胞毒作用[25]Fig 6 Cytotoxic effect of S2.2 adapter body loaded nanoparticles taxol on breast cancer cells[25]
尽管适配体有诸多优于抗体的性能,但仍存在一些不足之处如:适配体会被核酸酶降解导致过快的清除;筛选适配体的SELEX技术过程冗长;仍不能筛选出更具亲和力的适配体[33-34]。正因这些不完善的性能,限制了其在临床中的应用。由此我们可以着眼于采用非SELEX技术筛选出新的特异靶向乳腺癌的适配体、不断优化适配体性能、提高稳定性、延长半衰期、改进修饰基团等方面来设计出新的高性能的荧光探针和药物装载体。近年来,荧光引导手术(fluorescence-guided surgery, FGS)借助荧光探针的高选择性,定点标记肿瘤细胞,帮助医生术中实时识别肿瘤,获得肿瘤的完整形态,确保对肿瘤边缘的精准判定[35-36]。2006年德国杜塞尔多夫海涅大学的Stummer教授等[37]利用5-氨基乙酰丙酸盐(5-ALA)研发了恶性脑胶质瘤的荧光引导手术技术;2011年荷兰格罗宁根大学的Van Dam等[38]首次利用荧光引导手术对人卵巢癌进行了手术切除。随着适配体的发展,研究者们将关注转向了利用适配体作为靶向基元构建荧光引导手术。AS1411适配体交联金纳米颗粒构成荧光探针(AS1411-DA-AuNPs)[39],通过共聚焦显微镜,用乳腺癌细胞系MCF-7评估探针荧光成像的靶向性,效果显著。此外,构建了荧光引导CL1-5肺癌细胞系小鼠肿瘤手术技术平台,尾部注射荧光探针(AS1411-DA-AuNPs),在小动物活体成像系统(IVIS)下,对肿瘤进行了实时、精准的切除。虽然是在肺癌肿瘤模型下进行的适配体荧光引导手术,但在不远的将来,适配体荧光引导手术也可能会用在乳腺癌的临床应用中,这将成为另一个新的研究方向。总之,核酸适配体未来在乳腺癌诊断成像、靶向治疗及荧光引导手术方面有很大的应用前景。
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Application of aptamers in targeted breast cancer treatment
YUE Dongfang1,2, ZHANG Maihe3, XU Zhaochao2, ZHAO Haidong1
(1.DepartmentofBreastDiseases,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China; 2.KeyLaboratoryofSeparationScienceforAnalyticalChemistry,DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Dalian116023,China; 3.DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)
Breast cancer is the most common malignant tumors in women around the world, which causes serious damage to women's health. Therefore, it has the great significance to achieve early diagnosis and treatment for breast cancer. Aptamers are oligonucleotide sequences screened for the systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) and have good application prospect in cancer diagnosis and treatment. In this paper, we review aptamers targeted breast cancer therapy to explore the role as a carrier or probe in the diagnosis of breast cancer and to provide a new perspective for breast cancer diagnosis and treatment.
breast cancer; aptamers; SELEX; diagnosis
10.11724/jdmu.2017.02.17
岳东芳(1993-),女,七年制学生。E-mail:1289089797@qq.com
赵海东,教授。E-mail:z.hddl@hotmail.com
R73-34
A
1671-7295(2017)02-0181-08
岳东芳,张迈鹤,徐兆超,等.靶向乳腺癌的核酸适配体应用研究进展[J].大连医科大学学报,2017,39(2):181-188,192.
2016-11-02;
2017-03-28)