淫羊藿苷对CX3CL1诱导的单核细胞向人脐静脉内皮细胞迁移和黏附的影响及机制研究

付晓霞，罗云梅，刘 娟，刘 杰，李利生

(1.遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附属医院 临床医学研究所，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

淫羊藿苷对CX3CL1诱导的单核细胞向人脐静脉内皮细胞迁移和黏附的影响及机制研究

付晓霞1，罗云梅1，刘 娟2，刘 杰1，李利生1

(1.遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附属医院 临床医学研究所，贵州 遵义 563099)

目的 研究淫羊藿苷(icariin，ICA)对CX3CL1诱导的单核细胞(THP-1)向人脐静脉内皮细胞(HUVECs)迁移和黏附的影响及其机制。方法 采用Transwells联合培养THP-1和HUVECs，CX3CL1诱导THP-1向HUVECs迁移和黏附模型，并观察ICA(10-8、10-7、10-6mol/L)对该模型的影响。ICA预给药4 h后加入CX3CL1(50 ng/mL)继续培养24 h，移除Transwells及上室中的THP-1细胞，收集培养液并对迁移至下室的THP-1计数；免疫荧光双标法检测THP-1向HUVECs黏附的情况；Western blot检测CX3CR1、p-NF-κB p65和TNF-α蛋白水平。结果 与对照组比较，CX3CL1诱导THP-1向HUVECs迁移和黏附的数量明显增多(P<0.01)，伴有CX3CR1、p-NF-κB p65、TNF-α蛋白水平升高(P<0.05)；ICA预处理(10-8～10-6mol/L)能减少THP-1向HUVECs迁移和黏附的数量(P<0.05或P<0.01)，抑制CX3CR1、p-NF-κB p65、TNF-α蛋白水平的上调。结论 ICA(10-8～10-6mol/L)可抑制CX3CL1诱导的THP-1向HUVECs的迁移和黏附，作用机制可能与抑制CX3CL1/CX3CR1/NF-κB/TNF-α信号通路有关。

淫羊藿苷；CX3CL1；CX3CR1；核转录因子-κB；单核细胞(THP-1)；人脐静脉内皮细胞

血管炎症是动脉粥样硬化[1]、肺动脉高压[2]等疾病的重要病理特征，涉及大量的炎症介质和细胞。趋化因子CX3CL1主要表达于血管内皮细胞[3]，是CX3C亚家族的唯一成员，包括溶解型和膜结合型两种形式，二者均可与其受体CX3CR1结合[4]，经Gi蛋白偶联的信号转导，使表达该受体的细胞如淋巴细胞、单核细胞向内皮细胞招募、黏附并向中膜迁移，从而导致血管狭窄，甚至血管重塑[5]。抑制血管壁炎症性细胞浸润不仅可缓解炎症、还能够预防血管壁形态学改变。

淫羊藿苷(icariin，ICA)是我国传统中药淫羊藿的主要有效成分之一，具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、影响内分泌和改善心脑血管功能等多种药理作用[6-7]。而其对抑制细胞迁移黏附的作用鲜有报道。本实验采用单核细胞(Human acute monocytic leukemia cell line，THP-1)和脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs) 联合培养模型，初步探讨了ICA对CX3CL1诱导THP-1向HUVECs迁移和黏附的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 HUVECs和THP-1由湘雅医院中心实验室提供；ICA (经HPLC检测纯度≥98%)购自南京泽朗医药科技有限公司；胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；1640培养基购自Hyclone公司；Transwells购自美国Corning公司；重组人CX3CL1购自美国Peprotech公司；BCA和ECL发光剂购自江苏碧云天生物技术研究所；兔多克隆抗体CX3CR1、兔多克隆抗体 IκB-α、小鼠单克隆抗体CD14、TNF-α购自美国Abcam公司；兔多克隆抗体p-NF-κB p65，兔多克隆抗体NF-κB p65购自美国Cell Signaling Technology公司；兔抗Ⅷ因子抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；HRP标记的GAPDH抗体购自中国康成生物技术有限公司。

全波长酶标仪(型号：Multiskan)，美国Thermo scientific公司；凝胶成像系统(型号：Chemi Doc XR5)，美国Bio-Rad公司；倒置荧光显微镜(型号：1X73+DP73)，日本Olympus公司。

1.2 细胞培养 HUVECs和THP-1均培养于含10% FBS、100 U/mL青霉素及链霉素的1640培养基中，于37 ℃、5% CO2条件下培养，隔天换液，80%融合时，用2.5 g/L胰蛋白酶按1∶2比例消化传代贴壁细胞。

1.3 实验分组及药物处理 分为对照组，模型组(CX3CL1 50 ng/mL)，ICA-L、M、H组(CX3CL1 50 ng/mL + ICA 10-8、10-7、10-6mol/L)。ICA预给药4 h后加入CX3CL1 (50 ng/mL) 继续培养24 h。

1.4 THP-1的迁移情况 分别将THP-1(2×105个/mL)和HUVECs(2×105个/mL)接种于Transwells的上室和下室，建立联合培养体系，药物干预结束后移去上室，收集培养液进行细胞计数。

1.5 免疫荧光双标法测定THP-1的黏附情况 细胞接种与药物干预同1.4。干预结束后移去上室和培养液，PBS洗涤细胞3次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%的Triton X-100在室温下处理10 min，1%BSA孵育30 min，以CD14和Ⅷ因子抗体分别标记THP-1和HUVECs并在4 ℃中过夜，PBS洗涤细胞3次，在室温下孵育二抗75 min，DAPI染细胞10 min。倒置荧光显微镜拍照，并对THP-1计数即黏附细胞数。

1.6 Western Blot检测CX3CR1、p-NF-κB p65、NF-κB p65和TNF-α蛋白的表达 收集经处理的细胞，总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，热变性(95 ℃，10 min)后BCA试剂盒测定蛋白含量，按20 μg/10 μL每孔泳道蛋白上样，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗CX3CR1(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、TNF-α(1∶1 000)和GAPDH(1∶10 000)4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入二抗(羊抗兔，1∶3 000)室温下孵育1.5 h，TBST 洗膜，ECL发光液孵育2 min，经凝胶成像系统曝光成像，经Image J软件测定条带灰度值，分别计算CX3CR1、TNF-α与GAPDH及p-NF-κB p65与NF-κB p65灰度值的比值，即为目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学分析 实验数据采用SPSS 17.0软件进行ONE-WAY ANOVA处理，方差分析有差异者进一步做两两比较，方差齐者用LSD法，方差不齐用Dunnett’T3法，相关性分析采用Pearson法，P<0.05认为差异具有显著性。

2 结果

2.1 ICA抑制CX3CL1诱导的THP-1向HUVECs迁移 与对照组比较，CX3CL1刺激细胞24 h后，THP-1迁移的数量明显增多(P<0.01)。ICA各剂量组均可抑制THP-1向HUVECs迁移(P<0.01)，并具有剂量依赖关系(见图1)。

2.2 ICA抑制CX3CL1诱导的THP-1向HUVECs黏附 如图2所示，CX3CL1可明显诱导THP-1向HUVECs或培养板底部黏附，黏附细胞数达对照组的5倍。ICA(10-8～10-6mol/L)预处理可显著抑制CX3CL1所致的THP-1向HUVECs黏附(P<0.01)，但仍高于对照组。

A：代表性荧光图片(比例尺：50 μm) ，THP-1呈红色荧光，HUVECs呈绿色荧光；B：THP-1黏附细胞数统计柱状图。与对照组比较，##P<0.01；与模型组组比较，*P<0.05或**P<0.01。图2 ICA对CX3CL1诱导的THP-1向HUVECs黏附的影响

2.3 ICA对THP-1细胞CX3CR1和HUVECs p-NF-κB p65、TNF-α蛋白水平的影响 THP-1经CX3CL1处理后CX3CR1蛋白水平显著增高(P<0.05)，ICA(10-7～10-6mol/L)能抑制CX3CR1蛋白水平的上调(P<0.05)。HUVECs经CX3CL1处理后p-NF-κB p65和TNF-α蛋白水平高于对照组(P<0.05)，ICA(10-8～10-6mol/L)能抑制p-NF-κB p65和TNF-α蛋白水平的上调(P<0.05，见图3)。

与对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图3 ICA对THP-1细胞中CX3CR1及HUVECs中p-NF-κB p65、TNF-α蛋白水平的影响

2.4 THP-1向HUVECs迁移和黏附的细胞数量与THP-1细胞CX3CR1蛋白水平相关性分析 如表1所示，THP-1向HUVECs迁移和黏附的细胞数量与THP-1细胞CX3CR1蛋白水平呈显著正相关。

表1 THP-1向HUVECs迁移和黏附的细胞数量与THP-1细胞CX3CR1蛋白水平相关性分析

变量CX3CR1相关系数rP迁移细胞数0.850.034黏附细胞数0.850.034

3 讨论

炎症灶炎症细胞浸润是一个连续动态的过程，包括招募、黏附、聚集和迁移等环节。在血管壁炎症反应过程中炎症细胞黏附在内膜并向中膜迁移，本研究选用的Transwell孔径为8μm，模拟血管内膜的物理屏障功能，分析THP-1的迁移及随后向HVUECs黏附的情况，即先迁移再黏附，在时间顺序上与在体过程不同。

炎症趋化因子是一类趋化炎症细胞向炎症和损伤部位聚集的小分子蛋白，炎症趋化因子及其受体是治疗慢性炎症重要的药物作用靶点。趋化因子CX3CL1为跨膜蛋白质，主要在血管内皮细胞表达，当受到致炎因素刺激时ADAM17被诱导并将CX3CL1裂解生成大量的膜结合型和溶解型两部分，二者均可与其受体CX3CR1相互作用发挥其生物学功能，介导CX3CR1阳性细胞如中性粒细胞、单核细胞、NK细胞、T淋巴细胞等向血管内皮细胞迁移和黏附[8]。血管内皮是炎症细胞跨膜转移的第一道屏障，内皮细胞表面的CX3CL1被认为是控制炎症部位炎症细胞渗出的“门户”。本研究中使用的CX3CL1为溶解型，在50 ng/mL浓度时可显著诱导THP-1迁移并向HUVECs黏附，与Wang等[9]报道的一致。

ICA具有很强的抗炎作用，能够抑制 NF/κB p65信号通路的活化有效调节卵白蛋白诱导的大鼠哮喘模型细胞因子的平衡；通过活化PI3K/Akt信号通路、抑制NF-κB信号通路进而下调TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS mRNA表达，缓解LPS所致的肺部炎症等[10-11]。本研究发现ICA能够有效抑制CX3CL1诱导的THP-1向HUVECs迁移和黏附，在10-8～10-6mol/L浓度范围内抑制THP-1迁移呈明显的剂量依赖性，但抑制THP-1黏附效应在10-7mol/L和10-6mol/L之间无明显差异，提示10-8mol/L已接近最小有效浓度。

CX3CL1诱导细胞迁移和黏附与NF-κB有着密切的关系。NF-κB是一种重要的促炎通路，由p65(RelA)、RelB、c-Rel、p105/p50和p100/p52 5个成员组成[12]。在静息状态下，NF-κB以p65/p50二聚体形式与其抑制蛋白IκB结合存在于胞浆，当受到CX3CL1刺激时，NF-κB被激活，磷酸化的p65/p50迅速从胞浆转至胞核(尤其是p65亚型)，启动炎症级联反应，加速炎性疾病的发生与发展，为激活炎症细胞发生迁移黏附提供了一个重要的途径[13-14]；活化的NF-κB引起TNF-α表达的上调[15]，而TNF-α的上调又可进一步激活CX3CL1[3]。本实验给予CX3CL1(50 ng/mL) 干预24 h后，发现CX3CL1可上调p-NF-κB p65和TNF-α蛋白水平，表明NF-κB通路被活化。ICA能抑制CX3CL1 所致的p-NF-κB p65和TNF-α蛋白水平的上调，表明ICA抑制CX3CL1诱导的THP-1向HUVECs迁移和黏附与抑制NF-κB信号通路有关。

综上所述，本研究证实ICA能够抑制CX3CL1诱导的THP-1向HUVECs迁移和黏附，其机制可能与CX3CL1/CX3CR1/NF-κB/TNF-α信号通路有关。

[1] Dusi V,Ghidoni A,Ravera A,et al.Chemokines and heart disease:a network connecting cardiovascular biology to immune and autonomic nervous systems [J].Mediators of Inflammation,2016,2016(6):1-16.

[2] Avni T,Paret G,Thaler A,et al.Delta chemokine (fractalkine)-a novel mediator of pulmonary arterial hypertension in children undergoing cardiac surgery[J].Cytokine,2010,52(3):143-145.

[3] Wojdasiewicz P,Poniatowski L A,Kotela A,et al.The chemokine CX3CL1 (Fractalkine) and its receptor CX3CR1:occurrence and potential role in osteoarthritis[J].Arch Immunol Ther Exp,2014,62(5):395-403.

[4] Owlasiuk P,Zajkowska J M,Pietruczuk M,et al.Fractalkine-stucture,functions and biological acti-vity [J].Pol Merkur Lekarski,2009,26(153):253-257.

[5] Yang R L,Chang C C,Sheen J M,et al.Davallia bilabiata inhibits TNF-α-induced adhesion molecules and chemokines by suppressing IKK/NF-kappa B pathway in vvascular endothelial cells[J].The American Journal of Chinese Medicine,2014,42(6):1411-1429.

[6] 李利生，刘娟，罗云梅，等.淫羊藿苷对野百合碱诱导的肺动脉高压模型大鼠血流动力学的影响[J].遵义医学院学报,2016,39(3):229-232.

[7] Li L S,Luo Y M,Liu J,et al.Icariin inhibits pulmonary hypertension induced by monocrotaline through enhancement of NO/cGMP signaling pathway in rats[J].Evidence-based Complementary and Alternative Medicine,2016,2016(4):1-10.

[8] Ostuni M A,Guellec J,Hermand P,et al.CX3CL1,a chemokine finely tuned to adhesion:critical roles of the stalk glycosylation and the membrane domain[J].Biol Open,2014,3(12):1173-1182.

[9] Wang Y,Wang Y S,Song S L,et al.Icariin inhibits atherosclerosis progress in Apoe null mice by downregulating CX3CR1 in macrophage[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2016,470(4):845-850.

[10] Xu C Q,Le J J,Duan X H,et al.Molecular mechanism of icariin on rat asthmatic model[J].Chin Med J (Engl),2011,124(18):2899-2906.

[11] Xu C Q,Liu B J,Wu J F,et al.Icariin attenuates LPS-induced acute inflammatory responses:involvement of PI3K/Akt and NF-kappa B signaling pathway[J].Eur J Pharmacol,2010,642(3):146-153.

[12] Baud V,Collares D.Post-translational modifications of RelB NF-κB subunit and associated functions[J].Cells,2016,5(2):22.

[13] 刘远贵,李小慧,邓媛媛,等.蛇床子素抑制核转录因子-κB的激活减轻β淀粉样蛋白25-35片段诱导的大鼠神经元结构损伤[J].遵义医学院学报,2015,38(5):470-473.

[14] Sun S C,Ley S C.New insights into NF-kappa B regulation and function[J].Trends Immunol,2008,29(10):469-478.

[15] Xia F,Wang C,Jin Y,et al.Luteolin protects HUVECs from TNF-α-induced oxidative stress and inflammation via its effects on the Nox4/ROS-NF-κB and MAPK pathways[J].J Atheroscler Thromb,2014,21(8):768-783.

[收稿2016-11-16;修回2016-12-30]

(编辑：王静)

Effects and mechanisms of icariin on migration and adhesion of THP-1 to HUVECs induced by CX3CL1

FuXiaoxia1,LuoYunmei1,LiuJuan2,LiuJie1,LiLisheng1

(1.Key Lab of Basic Pharmacology of Education Ministry and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Education Ministry,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Institute of Clinical Medicine,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To investigate the effects and mechanisms of icariin (ICA) on migration and adhesion of human acute monocytic leukemia cell line (THP-1) to human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by CX3CL1.Methods Transwells were employed to establish the co-culture system of THP-1 and HUVECs,and to measure the migration and adhesion of THP-1 to HUVECs induced by CX3CL1.After 4 h of ICA administration,CX3CL1 (50 ng/mL) was added to co-culture system for 24 h.Then the upper chambers of transwells were moved,and the medium was collected for counting the number of the migrated THP-1.The number of adherent THP-1 to HUVECs was observed by immunofluorescence double labeling.Western blot technology was used to evaluate the protein level of CX3CR1,p-NF-κB p65 and TNF-α.Results Compared with the control group,the number of migration and adhesion of THP-1 to HUVECs induced by CX3CL1 was significantly increased (P<0.01),and the protein levels of CX3CR1,p-NF-κB p65 and TNF-α were also increased (P<0.05).Pretreatment with ICA could cut down the number of migration and adhesion of THP-1 to HUVECs in dose-dependent manner at the dosage range from 10-8mol/L to 10-6mol/L (P<0.05 orP<0.01),and inhibit the protein levels of CX3CR1,p-NF-κB p65 and TNF-α.Conclusion ICA (10-8～10-6mol/L) inhibit the migration and adhesion of THP-1 to HUVECs induced by CX3CL1 through inhibition of CX3CL1/CX3CR1/NF-κB/TNF-α signaling pathway.

icariin; CX3CL1; CX3CR1; NF-κB; THP-1; human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)

国家自然科学基金资助项目(NO：81260654)；贵州省科技厅攻关项目(NO：黔科合SY字[2011]3019)；贵州省教育厅重点招标项目(NO：黔教科2011019)。

李利生，男，副教授，研究方向：心血管药理，E-mail:medlls@sina.com。

R965

A

1000-2715(2017)01-0059-05