淫羊藿次苷 II下调APP/PS1转基因小鼠海马APP、Aβ1-42、RAGE蛋白水平并抑制炎症反应

曾令荣，尹彩霞，刘远贵，何莲子，晏灵莉，龚其海

(遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

淫羊藿次苷 II下调APP/PS1转基因小鼠海马APP、Aβ1-42、RAGE蛋白水平并抑制炎症反应

曾令荣，尹彩霞，刘远贵，何莲子，晏灵莉，龚其海

(遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099)

目的 探索淫羊藿次苷II(ICS II)对APP/PS1转基因小鼠海马APP、Aβ1-42、RAGE蛋白水平及炎症反应的影响。方法 野生型小鼠和APP/PS1转基因小鼠分为5个组：野生型对照组、野生型高剂量组、APP/PS1转基因组、APP/PS1转基因低剂量组和APP/PS1转基因高剂量组，每组15只。野生型小鼠为同月龄同背景C57BL/6J小鼠。低、高剂量组每日1次分别灌胃ICS II 10、20 mg/kg，野生型对照组和APP/PS1转基因组灌胃等体积生理盐水，连续7个月。随后取材，Western blot法检测小鼠海马组织淀粉样前体蛋白(APP)和β淀粉样肽1-42(Aβ1-42)蛋白水平，晚期糖基化终产物受体(RAGE)的蛋白表达，促炎细胞因子[肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和环氧合酶-2(COX-2)]蛋白表达，抗炎因子白细胞介素-10(IL-10)蛋白表达。结果 ICS II可显著降低APP/PS1转基因小鼠海马组织APP、Aβ1-42、RAGE蛋白水平，降低炎症因子COX-2、TNF-α蛋白水平，增加抗炎因子IL-10蛋白水平(P<0.05)。野生型小鼠给予ICS II后，上述指标无显著变化。结论 ICS II可下调APP/PS1转基因小鼠海马RAGE、APP、Aβ1-42蛋白水平和减轻炎症反应。

阿尔茨海默病；淫羊藿次苷II；β淀粉样蛋白；小鼠

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)主要病理特征为细胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)聚集形成的老年斑和细胞内tau蛋白异常磷酸化形成的神经原纤维缠结[1-2]。目前，AD的病因及发病机制还未完全明确。在AD发病的各种假说中，神经炎症假说是被认可的机制之一，该假说认为神经炎症可促进AD的发生与发展[3-4]。此外，Aβ与晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)结合后可激活小胶质细胞加速炎症反应[2]。有趣的是，AD脑内RAGE、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、环氧合酶-2 (cyclooxygenase，COX-2)蛋白水平显著上调[5-6]。目前，临床治疗AD的药物主要有多奈哌齐、卡巴拉汀、美金刚等。然而，这些药物由于价格昂贵，疗效有限，且毒副作用大，使得临床应用受限。因此，探究高效低毒的AD治疗药物具有重要意义。

淫羊藿为小檗科植物，主要用于补肾阳，强筋骨，祛风湿等[7]。淫羊藿次苷II(icariside II，ICS II)是淫羊藿的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用[8-9]。研究发现ICS II可抑制Aβ25-35诱导的类AD模型大鼠海马组织中白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、TNF-α、COX-2等炎性介质的过度表达，但是否抑制RAGE蛋白水平尚未清楚[4]。同时，APP/PS1转基因小鼠能更好的模拟AD发展进程。所以，本实验通过APP/PS1转基因小鼠，观察ICS II对其炎症反应和淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)Aβ1-42、RAGE蛋白水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及分组 APP/PS1转基因小鼠，(30±5) g，雄性，购自南京大学(国家遗传工程小鼠资源库)[合格证号：SCXK(苏)2015-0001]。饲养于SPF级动物房，5只/笼，环境温度(22±1) ℃、湿度60%±2%，早上8∶00点至下午20∶00点光照、下午20∶00至早上8∶00黑暗，每日循环，自由饮食。适应性饲养2周，将APP/PS1转基因小鼠随机分为3组：APP/PS1转基因组、APP/PS1转基因+ICS II低剂量组、APP/PS1转基因+ICS II高剂量组，每组15只。野生型(Wild type, WT)小鼠随机分为2组：野生型对照组，野生型+ICS II高剂量组，每组15只。WT小鼠为同月龄同背景C57BL/6J小鼠。于3月龄开始灌胃，每日1 次，连续7个月。低、高剂量组分别灌胃ICS II 10、20 mg/kg，野生型对照组和APP/PS1转基因小鼠组灌胃等体积生理盐水。

1.1.2 主要药品和试剂 ICS II(批号：140701，经HPLC检测，纯度>98%)：南京泽郎医药有限公司；一抗：APP(货号ab60097B)、Aβ1-42(货号ab10148)、TNF-α(货号ab66578)、RAGE(货号ab37647)、COX-2(货号ab52237)、IL-10[货号SC-1783(M-18)]、β-actin(货号AA128)、GAPDH(货号60004-1-Ig)；二抗：辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(货号A0216)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(货号A0562)；牛血清白蛋白(BSA)：北京索莱宝科技有限公司；脱脂奶粉：武汉博士德生物工程有限公司；BCA蛋白含量测定试剂盒：上海捷瑞生物工程有限公司；ECL 发光剂：上海七海复泰生物科技有限公司。

1.2 实验方法 Western blot法检测蛋白水平：小鼠腹腔注射7%水合氯醛麻醉后，取脑，冰上分离海马，储存于-80 ℃冰箱备用。提取海马组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。根据蛋白浓度计算所需变性蛋白量，制备样本。将样本加入SDS-PAGE凝胶梳孔中，电泳1.5 h，电转30 min(半干转)，将蛋白转印至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温闭封2 h，TBST洗膜(10 min×3次)。一抗：APP(1∶2 000)、Aβ1-42(1：2 000)、TNF-α(1∶1 000)、COX-2(1∶500)、IL-10(1∶2 000)、RAGE(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)，4 ℃孵育过夜(约16 h)，次日取出PVDF膜，TBST洗膜(10 min×3次)。二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，TBST洗膜(10 min×3次)。用ECL显影，应用凝胶成像系统获取曝光图像并测定分析光密度积分值。

2 结果

2.1 ICS II对APP/PS1转基因小海马组织APP、Aβ1-42蛋白水平的影响 Western blot法检测小鼠海马组织APP和Aβ1-42蛋白水平。如图1所示，经单因素方差分析，APP/PS1转基因组较野生型对照组小鼠海马组织中APP和Aβ1-42的蛋白水平明显增加(P<0.05)；ICS II低剂量组较APP/PS1转基因组海马组织APP蛋白水平降低(P<0.05)；ICS II高剂量组较APP/PS1转基因组海马组织APP、Aβ1-42蛋白水平明显减少(P<0.05)。

ICS II 10：ICS II 10 mg/kg；ICS II 20：ICS II 20 mg/kg；*和**分别表示与野生型对照组比较，P<0.05和P<0.01；#和##表示APP/PS1-ICS II 10、ICS II 20组与APP/PS1转基因组比较，P<0.05和P<0.01。图1 ICS II对APP/PS1转基因小鼠海马组织APP(A)、Aβ1-42(B)蛋白水平的影响

2.2 ICS II对APP/PS1转基因小鼠海马组织TNF-α、COX-2蛋白水平的影响 Western blot法检测小鼠海马TNF-α、COX-2蛋白水平。如图2所示，经单因素方差分析，APP/PS1转基因组较野生型对照组海马组织TNF-α和COX-2的蛋白水平明显增加(P<0.05)；ICS II高剂量组较APP/PS1转基因组海马组织TNF-α和COX-2蛋白水平明显减少(P<0.05)。

ICS II 10：ICS II 10 mg/kg；ICS II 20：ICS II 20 mg/kg；*和**分别表示与野生型对照组比较，P<0.05和P<0.01；#和##表示APP/PS1- ICS II 20组与APP/PS1转基因组比较，P<0.05和P<0.01。图2 ICS II对APP/PS1转基因小鼠海马组织COX-2(A)、TNF-α(B)蛋白水平的影响

2.3 ICS II对APP/PS1转基因小鼠海马组织IL-10蛋白水平的影响 Western blot法检测小鼠海马IL-10蛋白水平。如图3所示，经单因素方差分析，APP/PS1转基因组较野生型对照组海马组织IL-10蛋白水平明显减少(P<0.05)；ICS II高剂量组较APP/PS1转基因组海马组织IL-10蛋白水平明显增加(P<0.05)。

2.4 ICS II对APP/PS1转基因小鼠海马组织RAGE蛋白水平的影响 Western blot法检测小鼠海马RAGE蛋白水平。如图4所示，经单因素方差分析，APP/PS1转基因组较野生型对照组海马组织RAGE蛋白水平明显增加(P<0.01)；ICS II高剂量组较APP/PS1转基因组RAGE蛋白水平明显减少(P<0.01)。

ICS II 10：ICS II 10 mg/kg；ICS II 20：ICS II 20 mg/kg； **表示与野生型对照组比较，P<0.01；##表示APP/PS1- ICS II 20组与APP/PS1转基因组比较，P<0.01。图4 ICS II 对APP/PS1 转基因组海马组织RAGE

AD是一种中枢神经系统退行性病变的慢性疾病，其病理学进程中存在Aβ的异常沉积和持久性的神经炎症反应。APP/PS1转基因小鼠的海马组织中发现异常的Aβ沉积、神经炎症反应、突触损伤及神经元丢失等，模拟了AD的发生及发展过程。因此，该模式小鼠已被广泛的应用于AD病理机制及药物的研究[10-11]。本研究采用APP/PS1转基因小鼠，探究ICS II对其海马组织炎性因子的影响及相关蛋白的影响。结果发现，ICS II 20 mg/kg可下调APP/PS1转基因小鼠APP、Aβ1-42、RAGE、COX-2、TNF-α蛋白水平及上调IL-10蛋白表达。

研究证实，AD大鼠大脑皮层及海马区域APP蛋白明显增加[12]。在AD发生及发展过程中，APP通过有序的水解过程形成Aβ，其随着时间的增加聚集成小分子寡聚体，其中Aβ1-42神经毒性最强。同样，在AD患者及动物模型大脑中可发现Aβ1-42明显增加，最终导致其认知功能障碍[4,6]。本实验发现APP/PS1转基因小鼠组海马组织内APP、Aβ1-42含量显著增加，与上述研究结果一致。然而，给予ICS II 20 mg/kg后可同时下调APP/PS1转基因小鼠组海马组织APP、Aβ1-42蛋白水平，而ICS II 10 mg/kg也可下调APP蛋白水平。提示ICS II可通过抑制APP、Aβ1-42含量，从而发挥对APP/PS1转基因小鼠的神经保护作用。

APP/PS1转基因小鼠脑内有明显的Aβ沉积，沉积的Aβ可激活小胶质细胞和星形胶质细胞，而活化后的小胶质细胞和星形胶质细胞释放大量促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1β、COX-2，这些炎性因子诱导细胞内产生大量的氧自由基，从而损伤细胞，最终引发脑内神经炎症反应[2]。IL-10被证实是一种抗炎细胞因子，可抑制促炎因子TNF-α、IL-1β，IL-6的产生[2,13]。降低AD大鼠大脑海马组织中TNF-α、COX-2蛋白含量，或增加抗炎因子IL-10的蛋白含量可改善神经炎症反应，减缓AD的发展[6,13]。所以本研究进一步检测了TNF-α、COX-2、IL-10蛋白含量，结果发现APP/PS1转基因小鼠组海马TNF-α、COX-2蛋白水平显著增加，IL-10蛋白水平显著降低，与以往研究结果一致[13-15]。而ICS II 20 mg/kg可降低TNF-α、COX-2蛋白表达，上调IL-10蛋白含量，提示ICS II可改善APP/PS1转基因小鼠神经炎症反应。

RAGE属于细胞表面免疫球蛋白家族成员，可在脑内的神经元、胶质细胞和内皮细胞中表达[2,16]。同时，研究发现AD患者脑内RAGE表达上调，Aβ作为其配体可与小胶质细胞表面的RAGE结合，激活小胶质细胞，活化后的小胶质细胞分泌大量促炎细胞因子。Aβ又可上调RAGE蛋白和促进胶质细胞迁移至老年斑周围，加剧AD患者脑内炎症反应[2,17]。因此本研究检测了RAGE蛋白表达。结果发现APP/PS1转基因小鼠海马组织中RAGE蛋白水平显著增加，与文献报道一致[18]。而ICS II 20 mg/kg可下调RAGE蛋白表达，提示ICS II可下调APP/PS1转基因小鼠脑内的RAGE蛋白水平。

值得注意的是，在本实验中，ICS II 连续灌胃7个月20 mg/kg/d可降低APP、Aβ1-42、TNF-α、COX-2、RAGE蛋白含量，增加IL-10蛋白含量；而ICS II连续灌胃10 mg/kg/d对Aβ1-42、TNF-α、COX-2、IL-10、RAGE蛋白水平没有影响，推测可能是ICS II 10 mg/kg/d灌胃7个月尚未达到ICS II缓解神经炎症反应所需的阈剂量有关。

综上所述，本实验证实ICS II可降低APP/PS1转基因小鼠海马组织APP、Aβ1-42和RAGE蛋白表达水平，从而抑制其神经炎性反应。

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[收稿2016-12-07;修回2017-01-20]

(编辑：王静)

Icariside II down-regulates protein level of APP，Aβ1-42，RAGE and suppresses inflammatory response in APP / PS1 transgenic mice

ZengLingrong,YinCaixia,LiuYuangui,Helianzi,YanLingli,GongQihai

(Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education,Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To explore the effects of icariside II (ICS II) on the protein levels of amyloid precursor protein (APP), Aβ1-42and RAGE, and inflammatory response in APP/PS1 transgenic mice.Methods C57BL/6J wild-type (WT) mice and APP/PS1 transgenic mice were divided into 5 groups (n=15 in each group): WT+NS (volume-matched normal saline), WT+ICS II 20 (20 mg/kg), APP/PS1+NS (volume-matched normal saline), APP/PS1+ICS II 10 (10 mg/kg), APP/PS1+ICS II 20 (20 mg/kg). The mice received intragastric administrated once a day for 7 months. After the sacrifice of mice, Western blot assay was used to detect the protein levels of amyloid precursor protein (APP), β amyloid protein1-42 (Aβ1-42), receptor for advanced glycation end products (RAGE), tumor necrosis factor (TNF-α), interleukin-10 (IL-10), and cyclooxygenase-2 (COX-2).Results The protein levels of APP, Aβ1-42, COX-2, TNF-α, RAGE were increased in APP/PS1 group compared with those in the WT group (P<0.05). Moreover, the protein level of IL-10 was decreased in APP/PS1 group compared with that in the WT group (P<0.05). The treatment with ICS II (20 mg/kg) significantly decreased the protein levels of APP, Aβ1-42, COX-2, TNF-α, RAGE in APP/PS1group compared with those in APP/PS1 group (P<0.05). And IL-10 protein level was increased compared with that in APP/PS1 group (P<0.05).Conclusion ICS II down-regulates the protein levels of RAGE, APP, Aβ1-42, and suppresses inflammatory response in APP/PS1 transgenic mice.

Alzheimer’s disease; icariside II; β-amyloid protein; mice

贵州省淫羊藿开发利用科技创新人才团队项目[NO: 黔科合(2015)4023]。

龚其海，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：神经药理学，E-mail:gqh@zmc.edu.cn。

R965

A

1000-2715(2017)01-0022-05