壳聚糖-磺酸甜菜碱对人肝癌HepG-2细胞的siRNA递送实验研究

董 伟，李大玉，惠 景，范 芳，李长福，姜 念，刘 云，朱欣婷

(1.遵义医学院 贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治重点实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 生物化学教研室，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

壳聚糖-磺酸甜菜碱对人肝癌HepG-2细胞的siRNA递送实验研究

董 伟1,2，李大玉2，惠 景1,2，范 芳1,2，李长福1,2，姜 念1，刘 云1，朱欣婷1,2

(1.遵义医学院 贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治重点实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 生物化学教研室，贵州 遵义 563099)

目的 设计合成新型高分子材料壳聚糖-磺酸甜菜碱(CS-DMAAPS)化合物，并考察该材料与siRNA复凝后对人肝癌HepG-2细胞的转染能力。方法 采取Michael加成法将含C=C双键的磺酸甜菜碱化合物(DMAAPS)与壳聚糖(CS)偶联接枝；利用核磁共振氢谱进行结构表征；CCK-8检测材料的细胞相容性；荧光显微镜观察siRNA的转染效率；Real-time PCR检测转染siRNA后对Bcl-2 mRNA的沉默效率。结果 核磁共振氢谱数据表明：DMAAPS已成功枝接到CS上。荧光显微镜观察结果显示：质量比(m0/mt：CS-DMAAPS/siRNA)为32、16、8、4、2的复合颗粒分别转染人肝癌HepG-2细胞24 h后，转染率分别为33.78%、45.82%、50.98%、69.89%、81.22%。Real-time PCR检测结果显示：质量比为4的CS-DMAAPS/siRNA复合颗粒转染人肝癌HepG-2细胞48 h后，对人肝癌HepG-2细胞的Bcl-2基因沉默效率为26.8%。结论 壳聚糖-磺酸甜菜碱(CS-DMAAPS)化合物能实现siRNA对人肝癌HepG-2细胞的转染，且细胞相容性良好，能实现目标基因的部分沉默。

壳聚糖；磺酸甜菜碱化合物；复合颗粒；人肝癌HepG-2细胞；siRNA

上世纪60年代，著名分子生物学家Joshua Lederberg认为分子生物学最终的应用将是直接控制人类染色体上的某些核苷酸序列[1]。因此科学家们从上世纪90年代就开始进行基因治疗试验[2-3]，但随之发生的由于受试者对腺病毒载体的致命免疫反应而导致死亡的“杰辛格事件”[4-5]，以及由于逆转录病毒的异常整合诱发患者白血病的恶性事件[6]，人们对病毒性载体的安全性质疑极为强烈。病毒型载体虽然转染效率高，但它具有诸多缺陷，如毒性大、免疫反应强烈、基因容量小、靶向性差、制备过程复杂等[7]，并且病毒具有一定的致病性，因此安全性成了病毒型载体的致命缺点，并使之临床应用受到极大限制。因此，研究者将目光投向了非病毒载体的构建上。在众多非病毒载体材料中，最受人们关注的为壳聚糖这一含氮高分子化合物，其具有低毒性、生物安全性好、易修饰等特性；但由于其基因递送效率极低，获得高效率基因表达比较困难[8-11]，严重影响其进一步利用。因此，在壳聚糖的基础上进行改性，赋予其更强的基因递送能力是该领域的研究热点之一。

甜菜碱衍生物——N,N-二甲基(丙烯酰胺丙基)丙烷磺酸铵(DMAAPS)是一种两性盐，由于内盐分子内静电相互作用使其体现出超亲水性，两性盐改性的材料表现出强烈的抵抗非特异性结合的蛋白吸附、抵抗细菌粘附和生物膜形成的能力，在其作为基因递送材料进行转染时，易于形成纳米颗粒，并能够使其在进入细胞内之后免受核酸酶的降解，便于细胞摄取和内涵体逃逸[12]；因此，本研究试图利用上述甜菜碱衍生物的特性，采用化学偶联的方法将其与壳聚糖(CS)接枝，以期获得细胞相容性好，高效递送siRNA的新型壳聚糖衍生物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 RPMI-1640培养基、胎牛血清，美国Hyclone公司；PBS粉末，生工生物工程(上海)有限公司；N,N-羰基二咪唑(CDI)，上海百灵威公司；N-[(3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺(DMAPPA)、1,3-丙磺酸内酯，上海梯希爱公司；壳聚糖，浙江金壳药业有限公司；Bcl-2siRNA序列：sense strand,5’-GUGAAGUCAACAUGCCUGC-dTdT-3’; antisense strand,5’-GCAGGCAUGUUGACUUCAC-dTdT-3’参考文献[13]合成，并标记FAM荧光基团，委托上海吉玛基因公司合成；Real-time PCR引物：Bcl-2上游5′-GGATTGTGGCCTTCTTTGAG-3′；下游3′-CCAAACTGAGCAGAGTCTTC-5′。GAPDH上游5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′；下游3′-CTTCTGACACCTACCGGGGA-5′，委托生工生物工程(上海)有限公司合成；氘代三氟乙酸(TFA)，美国CIL公司；丙酮、乙酸，成都市科龙化工试剂厂。

1.1.2 肝癌细胞株 人肝癌HepG-2细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.1.3 主要仪器 3131型CO2培养箱、Multiskanspectrum全波长酶标仪，美国Thermo公司； NikonYS100荧光显微镜，日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 磺酸甜菜碱衍生物(DMAAPS)的制备 称量4.0 g DMAPPA溶于20 mL无水丙酮中，同时称取3.0 g 1,3-丙磺酸内酯溶于另20 mL无水丙酮中，待DMAPPA和1,3-丙磺酸内酯完全溶解后，将1,3-丙磺酸内酯在30 min之内逐滴加入到DMAPPA中，并不断搅拌，在室温25 ℃环境下反应16 h。反应完毕之后，取反应液离心过滤，得到白色沉淀，用无水丙酮反复清洗沉淀3～4次，最后真空干燥即得DMAAPS[14-16]。

1.2.2 壳聚糖-磺酸甜菜碱化合物(CS-DMAAPS)的合成 取壳聚糖1.0 g溶于1% 醋酸中，待完全溶解后加入0.223 g CDI(N,N-羰基二咪唑)搅拌1 h，分别取0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 g DMAAPS加入到壳聚糖溶液中，在室温25 ℃环境下搅拌反应24 h，3.5 KD分子量透析48 h，将透析后的液体真空冷冻干燥即得样品。

1.2.3 CS-DMAAPS的核磁共振氢谱表征检测 称取3 mg样品溶于 600 μL 5%的氘代三氟乙酸(TFA)溶剂中，利用400 MHZ核磁共振仪进行CS-DMAAPS的氢谱检测。

1.2.4 CS-DMAAPS与人肝癌HepG-2细胞的细胞生物相容性实验 将处于对数生长期的肝癌HepG-2细胞接种于96孔培基养板中，8×103个细胞/孔，加含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养14 h后弃去培养基，置换新鲜含10 %胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，每孔90 μL，设置6个复孔；同时每孔加入10 μL不同浓度的CS-DMAAPS溶液(6.25、12.5、25、50至100 μg/mL)；分别培养12、24、48 h后加入10 μL CCK-8溶液，利用酶标仪在450 nm处检测其吸光度。

1.2.5 CS-DMAAPS/siRNA复合颗粒的制备 将4 mg CS-DMAAPS溶于40 mL无菌水中，用0.22 μm微孔滤膜过滤，配成100 μg/mL CS-DMAAPS，53 ℃孵育10 min；用50 mmol/L的无菌硫酸钠溶液将siRNA-FAM分别稀释成3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL 的浓度，稀释后分别与CS-DMAAPS等体积混合，间歇涡旋25 s后，在室温(25 ℃)下静置30 min，制备出不同浓度的siRNA-FAM的复合颗粒，即质量比(m0/mt)分别为32、16、8、4、2的5个样本(m0为CS-DMAAPS，mt为siRNA)。

1.2.6 凝胶电泳迁移实验证明CS-DMAAPS颗粒与siRNA的结合 将CS-DMAAPS配制成1 μg/μL体系，分别取1、2、4、8 μL与2 μL浓度2 μmol/L的siRNA-FAM结合，琼脂糖凝胶电泳检测其结合吸附情况。

1.2.7 CS-DMAAPS/siRNA复合颗粒转染人肝癌HepG-2细胞 将人肝癌HepG-2细胞以4×105个/孔的密度接种于24孔培养板，当细胞融合度达75%左右，吸去每孔培养液，用未加血清的RPMI-1640培养基轻轻润洗3次，将质量比(m0/mt)32、16、8、4、2的5种CS-DMAAPS/siRNA-FAM复合颗粒分别加至相应培养孔中，每孔100 μL，再用无血清RPMI-1640培养基补足至400 μL。转染24 h后，在荧光显微镜下观察、拍照、计数，每孔取5个视野，计算出每个视野下的总细胞数和相同视野下荧光细胞数。转染效率=每个视野下的荧光细胞数/相同视野下的细胞总数×100%。随后选用m0/mt=8和m0/mt=4的CS-DMAAPS/siRNA-FAM复合颗粒分别转染人肝癌HepG-2细胞48、72、96 h后，按上述方法计算转染效率。

1.2.8 Real-time PCR 检测Bcl-2 mRNA水平的沉默效率 实验共分为3 组： Control组、CS-DMAAPS 组、CS-DMAAPS/siRNA-FAM实验组。用m0/mt=4的CS-DMAAPS/siRNA转染人肝癌HepG-2细胞 48 h后，按RNAiso Plus试剂盒说明书，提取各组细胞总RNA，用Real-time PCR仪检测(SYBR Green染料法)各组样品Bcl-2 mRNA 表达量，根据Ct值通过公式2-(△△Ct)进行相对定量分析计算可得Bcl-2 mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 CS-DMAAPS高分子材料的核磁共振氢谱 观察CS(见图1A)和CS-DMAAPS(见图1B)的1HNMR(D2O)谱图，依据各物质官能团特征峰归属及峰裂分现象，化学位移δ：2.0～1.8 ppm处有CS中-COCH3，-CH3的特征峰[17]，以此峰作为两图中各自的标准峰作积分高度对照；图1B中δ：3.2～3.3 ppm处有专属DMAAPS中-N+CH3的微小特征吸收峰[15]；对两图化学位移δ特征峰处进行积分比较，B图中δ：5.92 ppm处有峰且积分面积为1.88，说明CS上已经成功接枝上DMAAPS；且对比A、B图，B图中δ：5.5 ppm左右处由高峰变为低峰，峰有裂分现象，由原来的单峰变为多峰亦可说明C-C键间-H的增加； A、B图中δ：3.9 ppm处均有峰且积分面积为1 065.89、31.00，B图中δ：2.8 ppm处的峰积分面积2.14，在占整个峰积分面积中的比例相对于A图中δ：2.97 ppm处峰积分面积在占整个峰积分面积中的比例，仅为其比例的4%。受到杂质峰或溶剂峰的影响目标峰有所偏移属于正常现象，但这并不影响DMAAPS已成功接枝上CS的判断，综上判断：CS已经成功枝接DMAAPS。

2.2 CS-DMAAPS的细胞相容性评价 不同浓度的CS-DMAAPS作用于人肝癌HepG-2细胞后，在不同的时间点利用CCK-8法检测各组细胞的存活率；实验结果如图2所示：与空白对照组相比(P<0.05)，各CS-DMAAPS浓度组都表现出很低的细胞毒性；且当CS-DMAAPS高达100 μg/mL并作用48 h后，其细胞存活率也在90%左右，由此可见，CS-DMAAPS的细胞相容性很好。

图1 核磁共振氢谱峰面积积分数据图CS(A)和CS-DMAAPS(B)

图2 CS-DMAAPS对人肝癌HepG-2细胞的毒性

2.3 琼脂糖凝胶电泳证明材料与siRNA的结合 如图3所示：未经包裹的siRNA-FAM能通过电泳形成明亮的条带；当CS-DMAAPS与siRNA-FAM的体积混合比例为1∶2和1∶1(v/v)时，siRNA条带亮度明显降低；当材料与siRNA-FAM浓度比例为2∶1和4∶1(v/v)时siRNA条带基本消失；该现象说明CS-DMAAPS能通过表面-NH2和季铵正离子基团所携带的正电荷能将siRNA-FAM吸附住，并且经琼脂糖电泳也很难将siRNA从CS-DMAAPS上脱离开来；该现象说明CS-DMAAPS能与siRNA有效结合。

图3 CS-DMAAPS/siRNA复合物的凝胶阻滞电泳

2.4 检测CS-DMAAPS/siRNA-复合颗粒转染人肝癌HepG-2细胞的转染效率

2.4.1 不同浓度的CS-DMAAPS/siRNA转染人肝癌HepG-2细胞的转染效率 质量比(m0/mt)为32，16，8，4，2的CS-DMAAPS/siRNA复合颗粒分别转染人肝癌HepG-2细胞24 h后，转染效率分别为33.8%、45.8%、51.0%、69.9%、81.2%，呈现明显的剂量依赖性(见图4)。另外，荧光显微镜成像情况表明，携有FAM的复合颗粒转染人肝癌HepG-2细胞后能够很容易进入胞内(见图5)。

图4 CS-DMAAPS/siRNA转染人肝癌HepG-2细胞的效率

A:m0/mt=0; B:m0/mt= 8; C:m0/mt=4; 荧光光源(A,B,C); 明场(A1,B1,C1); 明场+荧光光源(A2,B2,C2)。
图5 CS-DMAAPS/siRNA转染后荧光显微镜成像情况(×100)

2.4.2 转染时间对转染效率的影响 选用m0/mt=8和m0/mt=4的CS-DMAAPS/siRNA复合颗粒分别观察转染后48、72和96 h 3个时间点的转染效率。如图6显示，随着转染后持续时间的延长，其转染效率在下降。

图6 转染时间对CS-DMAAPS/siRNA的转染效率的影响

2.5 Real-time PCR检测Bcl-2 mRNA水平的沉默效率 由图7可见，将m0/mt=4的CS-DMAAPS/siRNA转染人肝癌HepG-2细胞48 h后，Bcl-2 mRNA的表达量减少(P<0.05)，且Bcl-2 mRNA 水平的沉默效率为26.8%。

n=3，*：P<0.05。 图7 RT-PCR CS-DMAAPS/siRNA对Bcl-2基因表达的影响

3 讨论

目前，基因治疗载体系统主要包括两类：病毒载体和非病毒载体，两者在使用中都具有局限性。已知的病毒载体虽然转染效率高，但容易引起病毒野生型突变、免疫反应、潜在致癌性等[7]；非病毒载体虽难有高效率表达[8]，但却有病毒载体无法比拟的优点：如易降解，安全性较高且来源广泛。

非病毒载体中的壳聚糖(CS)具有高阳离子电势和较低的细胞毒性，是一种具有良好细胞相容性和生物降解性的天然高分子材料[18]。但是，CS的低转染率极大限制了其在基因递送中的应用[19]。既往研究表明，壳聚糖及其衍生物作为非病毒载体被广泛用于基因递送，壳聚糖-聚乙烯亚胺颗粒[20-23]是众多研究中报道最多的。随后，又报道了众多壳聚糖衍生物，如壳聚糖-三聚磷酸盐纳米颗粒[24-25]、聚乙烯亚胺-羧甲基壳聚糖聚合物[26]、壳聚糖-磷酰胆碱和大环多胺[27]、壳聚糖-聚L-精氨酸颗粒[28]、壳聚糖-硫胺素焦磷酸盐[29]、季铵盐化的壳聚糖[30]等，这些壳聚糖衍生物在保留了壳聚糖的低细胞毒性、高生物相容性的基础上，还具有壳聚糖无法比拟的高转染效率。分析这些壳聚糖衍生物，可发现它们具有一个共同点：壳聚糖接枝的化合物都含有氮元素，这为新型壳聚糖衍生物基因递送材料的合成提供了参考。

甜菜碱衍生物——N,N-二甲基(丙烯酰胺丙基)丙烷磺酸铵(DMAAPS)作为基因递送材料进行转染时，易于形成纳米颗粒，并能够使其在进入细胞内之后免受核酸酶的降解，便于细胞摄取和内涵体逃逸[12]。另有研究显示，高浓度的DMAAPS对许多酶及其他生物大分子的构象不但没有影响，甚至有一定保护作用[31-32]。此外，有研究报道了PEI枝接DMAAPS后具有良好的转染效率、低细胞毒性等优点[13-14]。受此启发，本实验在CS基础上成功枝接DMAAPS合成了一种新的基因递送材料。实验结果表明，质量比(m0/mt：CS-DMAAPS/ siRNA)为32、16、8、4、2的复合颗粒转染人肝癌HepG-2细胞24 h后，转染效率分别为33.78%、45.82%、50.98%、69.89%、81.22%。m0/mt=4的CS-DMAAPS/siRNA复合颗粒转染肝癌HepG-2细胞48 h后，对HepG-2的Bcl-2基因沉默效率为26.8%。

本实验首次将CS和DMAAPS枝连，将其作为基因递送材料转染人肝癌HepG-2细胞时，能够有效装载siRNA并通过细胞膜实现递送，表现出较高的转染效率且保持了良好的细胞相容性、低细胞毒性的优点，最终实现基因沉默。研究结果表明壳聚糖-磺酸基甜菜碱(CS-DMAAPS)化合物在递送siRNA方面具有潜在的应用价值。

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[收稿2016-12-10;修回2017-01-22]

(编辑：王静)

Research on siRNA delivery mediated by chitosan-culfobetaine on human hepatoma HepG-2 cells

DongWei1,2,LiDayu2,HuiJing1,2,FanFang1,2,LiChangfu1,2,JiangNian1,LiuYun1,ZhuXinting1,2

(1.Guizhou Provincial College-Based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Biochemistry and Molecular Biology,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective The aim of this study is to synthesize the chitosan-sulfobetaine (CS-DMAAPS) copolymer as siRNA delivery vector,and investigate the transfection efficiency on HepG-2 cells.Methods The sulfonic acid betaine (DMAAPS) with C=C was grafted onto chitosan (CS) by Michael addition method,and the structure of the copolymer was characterized with1H-NMR.The cytocompatibility of CS-DMAAPS was examined through CCK-8 method.The transfection efficiency of CS-DMAAPS was observed with fluorescence microscopy.And the silencing efficiency ofBcl-2 gene expression was detected after siRNA gene transfection.Results NMR data showed that DMAAPS had been successfully connected to CS.The transfection efficiencies of the copolymers with different CS-DMAAPS/siRNA mass ratio (m0/mt:32,16,8,4 and 2) were not same.They were 33.78%,45.82%,50.98%,69.89% and 81.22%,respectively.Real-time PCR results showed that the silencing efficiency ofBcl-2 gene expression in HepG-2 cells was 26.8% after transfection by using nanoparticles (m0/mt:4).Conclusion CS-DMAAPS could be a feasible new gene delivery material with good biocompatibility,which could delivery siRNA into HepG-2 to inhibit the expression ofBcl-2 gene.

chitosan; sulfobetaine compound; complex particles; hepatocellular carcinoma cells HepG-2; siRNA

贵州省科技厅社会发展攻关项目(NO：黔科合SY[2013]3008); 遵义医学院招标项目(NO：F-614)；贵州省教育厅特色重点实验室建设项目(NO：黔教合KY字[2014]212)。

朱欣婷, 女，硕士，副教授，研究方向：小分子抗癌药物研究与开发，E-mail:xintingzhu@126.com。

R735.7

A

1000-2715(2017)01-0042-07