抗菌肽在家蝇胚胎细胞中的表达及活性测定

王灵军，王 鑫，贺莉芳，马元芬，生 燕，刘 晖

(1.遵义医学院 基础医学院寄生虫学教研室，贵州 遵义 563099；2.眉山市彭山区人民医院 普外科，四川 眉山 620860；3.黔南民族医学高等专科学校 基础医学部病原生物学教研室，贵州 都匀 558000；4.遵义医学院 基础医学院形态学实验室，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

抗菌肽在家蝇胚胎细胞中的表达及活性测定

王灵军1，王 鑫2，贺莉芳3，马元芬4，生 燕4，刘 晖1

(1.遵义医学院 基础医学院寄生虫学教研室，贵州 遵义 563099；2.眉山市彭山区人民医院 普外科，四川 眉山 620860；3.黔南民族医学高等专科学校 基础医学部病原生物学教研室，贵州 都匀 558000；4.遵义医学院 基础医学院形态学实验室，贵州 遵义 563099)

目的 在原核表达家蝇抗菌肽Attacin基因的研究基础上，为进一步提高抗菌肽的活性，利用重组杆状病毒Bacmid-pFastBacTM-Attacin表达系统转染家蝇胚胎细胞系MDEC-07114，对其活性进行探索研究。方法 构建pFastBacTMHTA质粒，将重组质粒转化Escherichiacoli(E.coli)DH10细胞，通过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆。构建抗菌肽Attacin的家蝇胚胎细胞真核表达系统。构建Bacmid-pFastBacTM-Attacin表达系统并转染家蝇胚胎细胞，提取培养上清和细胞裂解物粗蛋白，纯化，SDS-PAGE和Western-Blot对蛋白表达情况进行检测、鉴定。结果 重组杆状病毒Bacmid DNA成功转染家蝇胚胎细胞，细胞出现分离、停止生长、直径变大等现象；培养上清和细胞裂解物蛋白经SDS-PAGE检测，在22 KD出现了1条特异性条带；通过Western-Blot实验检测目的蛋白在家蝇胚胎细胞中成功表达；通过细菌实验测得其产物有较好的抑菌活性。结论 与E.coliBL21(DE3)原核表达系统相比，家蝇胚胎细胞系灵敏度较好，但仍有较大提升空间。

抗菌肽；家蝇胚胎细胞；杆状病毒表达载体；真核表达

抗菌肽是生物体产生的一类具有抗菌作用的小肽类物质，是机体天然免疫系统的重要组成部分，具有抗菌谱广、活性稳定、不易产生耐药性等优点。抗菌肽除了在真核生物的天然免疫系统中扮演重要的角色之外[1-2]，还在食品、饲料、农业、医药领域具有重要的应用价值[3]，甚至可以有效作用于对常规药物表现出抗药性的病原微生物，因此得到了广泛的关注[4]，并且有望成为理想的抗生素替代品。目前已有多种抗菌肽从原核生物到有机生物体中得以成功分离并分类。 但在抗菌肽生产实践中还是面临诸多问题。由于许多抗菌肽具有较高的细胞毒性,其次抗菌肽的规模化生产也是制约抗菌肽实际应用的难题。基因工程技术因生产成本低、可规模生产，成为抗菌肽规模生产的一条理想途径。而利用基因工程技术生产抗菌肽，如何构建高效、稳定的表达系统是主要问题。抗菌肽是昆虫先天性免疫系统对各种病原微生物做出快速反应的重要组成部分[2]，由于抗菌肽本身具有抗菌活性，对宿主菌有杀伤作用，因而目前抗菌肽在原核中表达多采用融合表达方式。原核系统操作简便，但表达的蛋白往往不能有效正确的翻译，使得选择真核表达系统成为目前抗菌肽基因工程研究的热点[5-7]。昆虫杆状病毒表达系统具有安全性高、基因克隆容量大、具有完备的翻译后加工修饰系统、 高效表达外源基因、无内毒素污染等优点[8]，利用昆虫杆状病毒表达系统表达的外源蛋白，其功能和结构与天然蛋白相似，是实现大规模低成本生产基因工程产品的有效手段[9]。

本研究以家蝇抗菌肽Attacin为目的基因，利用含杆状病毒穿梭载体的Bacmid-pFastBacTM-Attacin和自行建立的家蝇胚胎细胞MDEC-07114构建抗菌肽Attacin的杆状病毒-家蝇胚胎细胞真核表达系统，为抗菌肽Attacin的生物学活性研究和家蝇胚胎细胞用于抗菌肽的基因工程生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 Attacin基因(Genbank登录号AY460106)、家蝇胚胎细胞系(MDEC-07114)、质粒PUC57、pFastBacTMHTA、DH10Bac购自美国Invitrogen公司；大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌由遵义医学院微生物学教研室惠赠。

昆虫细胞培养基(金普诺安蛋白质工程技术有限公司)；Cellfectin转染试剂(美国Invitrogen公司)；活性蛋白提取试剂盒、Ni-NTA SefinoseTMResin Kit、UNIQ-200柱式质粒中量抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；蛋白Marker(日本TaKaRa公司)；BCA蛋白定量试剂盒、羊抗鼠HRP标记二抗、羊抗兔HRP标记二抗(碧云天生物技术研究所)。DNA Mix酶、Trans2K(中国北京全式金生物技术有限公司)；Ni NTA亲和层析填料、ECL显色液(美国Thermo公司)；质粒提取试剂盒和DNA 凝胶回收纯化试剂盒(中国北京擎科新业生物技术有限公司)；Page Ruler Prestained Protein Ladder(美国Thermo公司)。

CO2细胞培养箱(美国SHEL公司)；倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；酶标仪、电泳仪、PCR仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)；电转仪PS-9(大连竞迈科技有限公司)；真空冷冻干燥机(美国Thermosavant公司)；恒温摇床(太仓市实验设备厂)。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与目的基因扩增 以课题组前期筛选的候选家蝇抗菌肽为目的基因，设计引物时分别加入酶切位点，扩增获得目的基因。PCR引物序列如下：

1.2.2 重组载体的构建及鉴定 将“1.2.1”中获得的目的基因和质粒PUC57分别用EcoR I、Pst I双酶切后进行连接，并将连接产物转化E.coliDH5α细胞。挑取单克隆进行菌落PCR验证，选取阳性转化子送至生工生物工程(上海)股份有限公司有限公司测序。

1.2.3E.coliDH10Bac感受态细胞制备 将E.coliDH10Bac菌液接种到含50 μg/mL卡那霉素和10 μg/mL四环素的LB液体培养基，过夜培养取20 μL接种于含50 μg/mL卡那霉素及10 μg/mL四环素的5 mL新鲜LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD=0.5；将备用的1.5 mL离心管和菌液置于冰块中预冷，吸取1.2 mL预冷的菌液至离心管，以5 000 rpm 4 ℃离心5 min，弃上清， 加入800 μL预冷的50 nmol/L CaCl2，轻轻悬浮并在冰上放置30 min；于4 ℃ 5 000 rpm离心2 min， 弃上清液，加 100 μL预冷的 50 mmol/L CaCl2，轻轻悬浮，加入等体积预冷的40%甘油，吹打混匀后分装，保存在-80 ℃。

1.2.4 重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-pFastBacTM-Attacin的制备 将解冻后的感受态DH10Bac细胞，转入1.5 mL Ep管里，加入连接产物20 μL，混匀后，冰上孵育30 min；42 ℃热休克45 s，后置于冰上2 min。加入900 μL LB培养基，培养后离心，弃去上清，轻柔吹起沉淀，混匀；吸取10 μL已转化细胞涂布于IPTG-X-gal筛选平板后培养48 h。挑取白色单菌落，以Bac上的M13引物进行菌落PCR验证，产物电泳分析。

1.2.5 Attacin在MDEC-07114细胞中的表达及活性测定

1.2.5.1 家蝇胚胎细胞的转染及重组病毒的扩增测定 取对数生长期的MDEC-07114细胞进行实验[10]。将制备的重组杆状病毒Bacmid-pFastBacTM-Attacin转染家蝇胚胎细胞，分别于感染0、48、72 h记录细胞形态，设定常规方法培养为对照组。扩增低滴度P1毒株，从而产生高滴度的毒株P2(滴度为1×107pfu/mL到1×108pfu/mL)，接种活力>97%的MDEC-07114细胞6×106个至培养瓶，加培养液至6 mL，加转染后的病毒上清60 μL(MOI=0.1)培育，离心收集上清。

1.2.5.2 抗菌肽Attacin的表达测试 将杆状病毒株P2转染MDEC-07114细胞，收集培养72 h细胞和培养上清，一步法昆虫细胞活性蛋白提取试剂盒提取细胞裂解物的粗蛋白，上清和细胞裂解物粗蛋白经镍柱亲和层析纯化，BCA法测定蛋白质含量、SDS-PAGE分析鉴定纯化前、后各蛋白种类。

1.2.5.3 抗菌肽Attacin抑菌活性、稳定性检测 采用琼脂孔穴扩散法来初步检测表达产物的抗菌活性及抗菌谱。将处于对数生长期的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌株配置成0.5个麦氏单位的悬浮液，涂布于LB培养板，晾干。将4张重叠的药敏纸片分别用灭菌双蒸水、细胞裂解物、上清提取物、青霉素储存液(58.7 μg/mL) 、庆大霉素储存液(96 μg/mL)浸湿，铺至培养板，培养后观察抑菌圈大小，以空载体上清液作为阴性对照。

1.2.5.4 不同P2感染量下的目的蛋白的表达与鉴定 设置50、100、200、250、500 μL P2感染组及空白对照组，将细胞接种于6孔板，培养72 h后，对培养上清进行蛋白提取、纯化后进行Western Blot检测，观察结果。

2 结果

2.1 目的基因Attacin的克隆及原核载体构建和鉴定 以筛选的目的基因Attacin为模板，PCR获得目的基因克隆入载体PUC57质粒，经蓝白斑筛选后生工生物工程(上海)股份有限公司测序获得阳性克隆；转化入DH5α感受态细胞进行扩增，PUC57重组质粒经EcoR I、Pst I双酶切后，经电泳鉴定，出现长度约为700 bp目的基因和2 710 bp PUC57质粒条带(见图1)。

M：DNA marker；1：PUC57-Attacin双酶切。图1 重组质粒的双酶切鉴定

2.2 真核表达载体Bacmid-pFastBacTM-Attacin的构建 将上述获得的片段亚克隆入pFastBacTMHTA供体质粒，将重组质粒转入DH10Bac细胞，鉴定出阳性克隆后，提取重组Bacmid，用M13通用引物扩增，1%琼脂糖凝胶电泳。未插入目的片段的pFastBac转座后扩增产物长度为2 430 bp，重组Bacmid的扩增产物约为3 100 bp(见图2)。与理论值一致，证明重组Bacmid构建成功。

2.3 Bacmid转染MDEC-07114细胞 用Bacmid对家蝇细胞进行转染，分别于感染0、48、72 h观察细胞变化，观察显示：对照组细胞形态无明显变化，细胞呈圆形梭形及多边形，透亮，生长速度无明显变化(见图3A)； 病毒组细胞体积相较与对照组略有增大，到48 h时，病毒组大部分细胞停止生长，体积不再增大，细胞核增大、显示不清部分充满细胞，出现小泡(见图3B)；72 h病毒组细胞停止生长，有颗粒出现，部分从培养瓶脱离(见图3C)。

M：DNA marker；1、3、5：Bacmid-pFastBacTM-Attacin PCR产物；2、4、6：阴性克隆。图2 重组质粒的PCR鉴定

A：对照组(×400)，箭头所指为细胞核；B：48 h病毒组(×400)，箭头所指细胞出现小泡；C：72 h病毒组(×400)，箭头所指细胞呈颗粒状。图3 Bacmid转染家蝇细胞结果

2.4 抗菌肽Attacin预表达测试及目的蛋白的纯化与分析 BCA法测得上清总蛋白浓度为5.5 mg/mL，细胞裂解物总蛋白浓度为3.0 mg/mL，上清纯化产物蛋白含量为0.53 mg/mL，细胞裂解物纯化蛋白含量为0.12 mg/mL。SDS-PAGE检测经镍柱纯化前后的MDEC-07114细胞培养上清和细胞裂解物，在22 KD附近出现特异性条带，与目的蛋白的理论分子量21.78 KD基本一致(见图4)。

Western Blot结果分析各实验组灰度值明显高于对照组，说明各组细胞培养上清均有抗菌肽Attacin的表达 (见图5)。

M：marker；1：细胞裂解物总蛋白；2：细胞裂解纯化物；3：上清总蛋白；4：上清纯化物。图4 SDS-PAGE分析Attacin

图5 不同病毒用量组的抗菌肽Attacin表达(A)和灰度值柱形图(B)

2.5 抗菌肽Attacin活性及耐受性分析 抗菌活性检测：MDEC-07114细胞表达的抗菌肽Attacin对供试菌株均出现大小不等的抑菌圈，显示均有较强的抗菌活性(见图6)。热稳定性检测：MDEC-07114细胞表达抗菌肽Attacin对温度有较好的耐受性，对大肠杆菌的抗菌活性在时间1～20 min，温度60～100 ℃，没有太大变化，甚至100 ℃、30 min时仍具有抗菌活性(见图7)。酸碱耐受性检测：分别用pH 5.0～10.0的溶液作用于家蝇细胞表达抗菌肽Attacin后发现对大肠杆菌进行抑菌试验发现其仍具有抗菌活性(见图8)。

A：大肠杆菌；B：金黄色葡萄球菌；C:枯草芽孢杆菌。1：灭菌双蒸水；2：上清提取物；3:细胞裂解物；A4：庆大霉素；B4,C4：青霉素。图6 抗菌肽对供试菌株的抑菌效应

图7 不同温度和时间下Attacin对大肠杆菌的抗菌效果

3 讨论

抗菌肽因其独特的抗菌效应及作用机制，一直受科研工作者的热捧。抗菌肽是家蝇自身免疫体系的重要组成成分，在一定程度上对原虫、细菌、病毒、肿瘤等均有抑杀作用[11]。原核表达系统虽然优势明显、应用广泛，但其不能对蛋白质进行有效的翻译后修饰(如二硫键形成、蛋白质折叠等)，存在一定局限性。而真核细胞表达系统的翻译后修饰机制接近天然形式，可用于不适宜原核系统如E.coli表达系统的蛋白质生产。另外，由于抗菌肽本身具有抗菌作用，表达产物常常对宿主会产生反馈抑制作用，若直接采用原核表达系统，会影响其进一步表达。

昆虫细胞表达系统的细胞生长条件简单，不需要 CO2，适于高密度悬浮培养，表达水平高，含有哺乳细胞表达系统的诸多翻译后修饰。Hellers等通过将cecropin肽原的前体片段克隆到苜蓿斜纹蛾多角体病毒启动子的下游，成功构建了昆虫病毒表达系统，此后多名学者利用昆虫细胞成功构建抗菌肽基因的表达系统，且产物产量增加并保留特有的生物活性[12]。现在世界上已建立400多种昆虫细胞系，我国有粘虫、家蚕、粉纹夜蛾等20余株昆虫细胞系，广泛应用于农业、医药、生物学领域。昆虫细胞主要应用于杀虫剂和利用杆状病毒大量表达外源基因研究。随着昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统的广泛应用，病毒表达载体的研发获得迅速发展，细胞生长培养基也已商品化。虽然近年来从不同的昆虫中建立了许多的细胞系，但在蛋白表达方面表现优秀的细胞系不多， Protein Science公司报道了细胞系Express SF+，该细胞系比现在杆状病毒载体系统Sf9更优秀[13]。目前Sf9和High-5细胞系是病毒表达系统中运用最为广泛的，许多学者通过各种技术改造，以期获得具有活性、高表达的的产物。赵昆[14]等将牛抗菌肽Bac7-Bac5-βdefense串联基因克隆到BAC-To-BACTM重组杆状病毒表达系统的pFast HTB载体中，获得重组杆状病毒穿梭载体，转染sf9细胞，获得对大肠杆菌有抑菌作用的目的蛋白。

家蝇胚胎的细胞系MDEC-07114是本课题组自行建立，能够稳定传代的昆虫细胞系。此外，验证其能否高效敏感的作为抗菌肽表达工具细胞，非常值得尝试。因此，本研究成功将包含家蝇抗菌肽Attacin基因的杆状病毒表达载体转染到家蝇细胞系MDEC-07114，后经SDS-PAGE和Western-Blot检测证实抗菌肽Attacin的表达。由此可见，课题组自建家蝇胚胎细胞系MDEC-07114可用作抗菌肽Attacin的真核表达工具，该表达系统的建立不仅为抗菌肽的生产和进一步通过获得的纯化抗菌肽用于抗菌、抗肿瘤等机理研究打下基础，也为自建昆虫细胞系作为工具细胞进一步推广应用提供方向。

此外，本研究不仅探讨了抗菌肽对致病菌的抑菌作用，还研究了其对有益菌的影响，为后续深入研究抗菌肽的抑菌能力及种类奠定了基础。该抗菌肽对供试菌株的抑菌结果也说明构建好的抗菌肽的线性功能区域尚未形成靶向体，因此也没有识别特定微生物的作用。该类抗菌肽可同时作用于多种有害微生物，而对有益菌却不产生过多的影响[15-16]。这对维持动物胃肠道菌群平衡及健康方面也具有一定的意义。

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[收稿2016-12-30;修回2017-01-24]

(编辑：王静)

Expression and biologic activity of antimicrobial peptide attacin from housefly embryos cells

WangLingjun1,WangXin2,HeLifang3,MaYuanfen4,ShengYan4,LiuHui1

(1.Department of Parasitology,School of Basic Medical Sciences,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of General Surgery,Pengshan District people's Hospital,Meishan Sichuan 620860,China; 3.Department of Pathogenic Biology,College of Basic Medical Science,South Guizhou Medical College,Duyun Guizhou 558000,China; 4.Department of Morphology,School of Basic Medical Sciences,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To express antimicrobial peptide in housefly embryos cells by using the recombinant baculovirus Bacmid-pFastBacTM-Attacin,and then further investigate the biologic activity of Attacin.Methods The recombinant plasmid pFastBacTMHTA was constructed,and then transformed into competent cell ofEscherichiacoli(E.coli) DH10Bac.Blue & white selection was performed for choosing positive clone.Subsequently,the housefly embryonic cells (MDEC-07114) were transfected with the prepared recombinant baculovirus Bacmid-pFastBacTM-Attacin.The crude proteins were extracted from the culture supernatant and cells,and then purified with the nickel column.The protein expression was detected by SDS-PAGE and Western Blot.Results The housefly embryonic cells could be successfully transfected by recombinant baculovirus.And the transfected cells showed series of abnormal phenomena such as separation,growth arrest,bigger diameter,etc.The crude proteins extracted from the culture supernatant and cells were analyzed by SDS-PAGE.In the results,a specific band with the molecular weight of 22 KD was observed,which was identified as Attacin through Western Blot.The peptide was certified to have a good antibacterial activity.Conclusion Compared with the prokaryotic expression of antimicrobial peptide inE.coliBL21,the eukaryotic expression in MDEC-07114 cell is more sensitive,but there is still room for improvement.

antibacterial peptide; housefly embryos cells; baculovirus expression vector; eukaryotic expression

卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室开放课题(NO：WSBKTKT201101)；贵州省教育厅医学昆虫资源开发利用创新团队资助项目(NO：黔合教人才团队字[2014]39)。

刘晖，女，硕士，教授，研究方向：医学昆虫资源开发，E-mail:179433317@qq.com。

R384.2

A

1000-2715(2017)01-0053-06