传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)分离株病原学研究及全基因组序列分析

焦 雪 , 吉尚雷 , 张培军 , 冷东泽 , 茆安亭 , 李月红

(1.吉林农业大学动物科学技术学院, 吉林长春130118; 2.吉林省卫生检测检验中心, 吉林长春130118)

传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)分离株病原学研究及全基因组序列分析

焦 雪1, 吉尚雷1, 张培军2, 冷东泽1, 茆安亭1, 李月红1

(1.吉林农业大学动物科学技术学院, 吉林长春130118; 2.吉林省卫生检测检验中心, 吉林长春130118)

为初步了解东北地区某虹鳟养殖场的一株传染性造血器官坏死病病毒株的病原学特征，将该病毒株进行虹鳟鱼苗人工回接感染试验。结果显示，一周内人工感染试验鱼均出现明显的临床症状。将病死虹鳟鱼苗研磨过滤除菌后接种到胖头鱼肌肉细胞系(FHM)，出现了特征性病变(CPE)，用传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)4组水生动物病毒的6对特异性引物对该毒株进行race-PCR，扩增其全长。结果显示，该病毒基因组全长为11 132 nt，基因组序列中4种核苷酸G、A、T、C含量分别为24.28%、28.67%、19.46%、27.59%。将序列与多株GenBank中已发表的IHNV毒株相应基因进行比较。结果显示，分离株G基因与韩国株ChYa07和PcKw11同源性较高，分别为97.8%和97.5%，其进化树分析结果显示，CJ-13株与韩国株和日本株在遗传进化关系上较近。

传染性造血器官坏死病病毒(IHNV) ； 流行病原学 ； 全序列

传染性造血器官坏死病(infectious haematopoietic necrosis,IHN)可引起虹鳟鱼和鲑鱼全身性、致病性的急性传染病[1]。20世纪中期，美国首先发现了IHNV，不久，欧洲地区一些临近的国家相继发现，20世纪70年代末，IHNV由北美洲传到太平洋西北的日本北海道附近，1985-1995年，该病进入中国东北境内[2]。1992年，德国科学家从虹鳟鱼体内分离出IHNV；2006年，刘荭[3]在患病虹鳟鱼等病鱼的鱼卵中检测出IHNV。

传染性造血器官坏死病病毒为诺克拉弹状病毒属[4]，病毒粒子是单股负链线状单链RNA，其基因组成部分由3′-5′端依次是前导区、结构蛋白基因区与各基因之间的连接区以及5′端不转录的拖尾序列。排列方式为3′-N-P-M-G-NV-L-5′。根据地理区域可分U基因型、L基因型、M基因型3种毒株，M基因组比U和L基因组的基因多样性更高[5]。

2014年，吉林省延边自治州部分冷水鱼场的虹鳟鱼苗疑似被IHNV感染患病，将部分鱼苗分离到的病毒毒株进行虹鳟鱼苗回归感染试验，以及病毒滴度测定试验，确定IHNV为病鱼死亡的主要病原，明确其致病性；并对病毒株进行全基因组测序，与IHNV其他株亲缘关系进行了初步分析，确定其与其他区域病毒之间的进化关系，并将主要蛋白序列进行同源性分析，掌握该分离株的遗传背景，旨在研究新分离毒株的传播途径，为中国东北地区传染性造血器官坏死病的预防检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 病死鱼取自吉林省延边自治州青龙渔场的虹鳟鱼苗，体长1.5～3.5 cm；胖头鱼肌肉细胞系(FHM)由本实验室保存。

1.2 主要试剂 M199培养基由实验室自行保存，特级胎牛血清，购自Gibco公司；cDNA反转录试剂盒、胶回收纯化试剂盒、EXTaqDNA、NotI、XhoI和EcoRI，购自宝生物工程(大连)有限公司；TRIZol聚合酶，购自Invitrogen公司；质粒DNA小量试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 病毒分离 取2 cm大小的虹鳟鱼苗剪碎并磨成粉末，加入3 mL M199培养基于1.5 mL离心管中离心15 min(7 000 r/min 4 ℃)，吸取上清并用滤膜过滤，然后进行1∶10、1∶50、1∶100稀释，抽取50 μL上清加入FHM单层细胞中，置于15 ℃培养1周。1.4 病毒滴度测定 病毒悬液按照10-1-10-10做10倍稀释，接种于长满FHM单层96孔板中。每个稀释度进行8孔重复，15 ℃吸附1 h候加入新鲜的M199培养基15 ℃下培养。阳性对照为未稀释的细胞毒，阴性对照为正常细胞，7 d内观察CPE，TCID50效价计算采用Karber法，即LgTCID50=L-D(S-0.5)，L为最高稀释度的对数，D为稀释度对数之差，S为阳性孔比率总和。

1.5 IHNV全基因组扩增 根据GenBank中登录的IHNV全基因组序列WRAC株(NC_001652.1)设计了6对相互重叠片段的引物，采用50 μL的PCR反应体系：cDNA产物3 μL，10×Taq酶Buffer 5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L each)2 μL，Mg2+(50mmol/L)2 μL，上下游引物(40 μmol/L)各2 μL，0.5 μLTaqDNA polymerase(invitrogen)，补ddH2O至50 μL。PCR 反应条件为：首先94 ℃预变性5 min，再94 ℃变性4 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行结果判定。3′末端测序采用RACE法，通过引物Oligo(dT)将mRNA逆转录为cDNA，以该cDNA为模板，以IHNV特异性引物3′RACE GSP和Oligo(dT)为引物进行PCR，扩增3′末端区的基因组。5′末端的基因组序列按照RACE试剂盒进行扩增，引物序列见表1。

表1 扩增IHNV全序列的引物

1.6 序列及同源性分析 目的片段连接载体后转入感受态细胞，提取质粒酶切验证，将酶切正确的菌液进行测序，每个测序的阳性质粒都设3个平行组，以保证测序结果的正确性。将获得的DNA序列结果利用DNAStar软件进行同源性比对，利用 MEGA5.2 分析遗传进化关系构建系统进化树。所参考的毒株以及登录号为：220-90株(GQ413939.1)，carson-89株(AY442508.1)，HO-7株(AY442512.1)，HV7601株(AB231658.1)，LWS-87株(AY442515.1)，RB-76株(AY442516.1)，SRCV株(AY442517.1)，WRAC株(AY442518.1。1.7 动物回归试验 选取体重约为50 g的健康虹鳟鱼70尾，平均分成2组饲养3周。将病毒液(TCID50效价为10-5.47/0.1 mL)通过腹腔注射途径接种到无任何病症的健康鱼体内，每尾0.3 mL，一共25尾，水温保持在8 ℃～12 ℃；未接种的健康鱼为对照组，连续观察30 d。

2 结果

2.1 病毒分离 按照1∶10、1∶50、1∶100的比例稀释的病料组织匀浆上清依次接种到FHM细胞后的第2天、第4天和第7天细胞收缩变圆，出现明显的空斑，最后大部分细胞崩解、脱落。而未接毒的对照组细胞生长状态良好(图1)。

图1 正常的FHM细胞和接种后出现EPC的FHM细胞(100×)

2.2 病毒滴定测定结果 病毒悬液按照10-1-10-10连续10倍稀释后接种在单层的FHM细胞中，采用Karber法计算出第二代细胞培养物的TCID50效价为10-5.47/0.1 mL。2.3 IHNV全基因组扩增 通过对RT-PCR反应条件的优化，利用设计的6对特异性引物，扩增出了覆盖IHNV CJ-13株全基因组6个片段。扩增后的产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测均为单一条带，且各扩增片段大小与预期值一致(图2)。

图2 PCR扩增产物

M：250 bp DNA Ladder；1～6分别为IHNV引物1、2、3、4、5、6

2.4 IHNV全基因序列测定 将RT-PCR扩增的各个基因片段分别连接于pGEM-T Easy 载体，各基因片段分别筛选3个平行阳性重组质粒进行测序。将测得的各段基因序列用DNAStar 软件进行拼接校正后获得IHNV全基因序列。该病毒基因组全长为 11 132 nt，基因组序列中4种核苷酸G、A、T、C含量分别为24.28%、28.67%、19.46%、27.59%。对IHNV CJ-13株的基因结构特点进行了分析和预测了蛋白表达量(表2)。与其他弹状病毒一样，分离株包含6个基因编码的蛋白序列，排列方式为3′—N—P—M—G—NV—L—5′。首先是由不能被翻译的前导区，然后依次是核衣壳蛋白(N登录号：KR269772)、与聚合酶相关的磷酸蛋白(P登录号：KR269773)、基质蛋白(M登录号：KR363256)、糖蛋白(G登录号：KR537869)、独特的非病毒结构蛋白(NV登录号：KR814487)及病毒聚合酶蛋白(L登录号：KR814488)，最后是5′端的尾随序列。各基因之间的连接区将结构蛋白基因分离。

2.5 IHNV核蛋白G基因序列分析 与VHSV两种病毒的N基因极为相似，所以针对N基因设计引物进行RT-PCR难以区分两种病毒，一般区分 IHNV 都以G基因进行区分，因为IHNV病毒G基因序列变异系数较小[6-7]，将分离株G基因与多株IHNV参考株进行核苷酸同源性比较并做系统发育树分析，可见分离株G基因与韩国株ChYa07和PcKw11同源性较高，分别为97.8%和97.5%，其推导的氨基酸序列同源性为97.5%和98.2%。与其他参考株核苷酸同源性为94.8%～96.7%，推导出的氨基酸同源性为94.5%～95.8%。从G基因的进化树上看，分离株G基因与韩国分离的2株相对较近，表明亚洲分离株与美国分离株、欧洲分离株进化关系较远，明显不在同一个进化分支上。

3 讨论

目前，传染性造血器官坏死病病毒细胞培养技术依然是水生动物病毒诊断的重要手段，本研究将处理过的疑似病料接种到敏感细胞系FHM中，通过观察典型的CPE和电镜检测病毒形态初步确定为IHNV，采用race-PCR方法，成功扩增出IHNV全基因组序列。

表2 IHNV CJ-13株的基因结构特点及蛋白表达

通过对数据进行分析，其结果显示，IHNV基因包含6个ORF，分别为核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)、独特的非病毒结构蛋白(NV)及病毒聚合酶蛋白(L)。G蛋白是传染性造血器官坏死病病毒编码抗原决定簇的主要蛋白,能刺激机体产生中和抗体，同时也是个很好的检测抗原。G蛋白的N端具有一段疏水性的信号肽,在内质网中被切除后成为成熟的G蛋白，所有弹状病毒G蛋白都属于单一的I型跨膜糖蛋白，由约500个氨基酸组成。不同属的弹状蛋白其G蛋白的氨基酸同源性很低，但在结构组成上较为保守，都含有一个疏水的信号肽、两个糖基化位点、两个乙酞化位点和一个疏水的细胞质尾。本研究中分离株的G蛋白基因序列总长1 527 bp，包含G蛋白的全长基因，编码508个氨基酸，预测表达蛋白量为56 kDa。

我们发现，在细胞接种病料时，刚被处死的活鱼和保存于液氮数日的病鱼组织均可以使得敏感细胞FHM出现特征性病变。所以温度是影响IHNV感染发病的重要因素之一[8-9]，水温在8 ℃～10 ℃时发病率最高，水温超过15 ℃时可使发病停止。饲养鱼苗时，我们给部分正常鱼苗更换冷水后在3～8 h内80%鱼苗出现了临床症状，12小时内死亡率达到了100%。另外，鱼的大小是另一个重要的影响因素，2月龄以下的鱼苗死亡率可达100%，7月龄以上的一般仅有10%左右的死亡率[10]。

研究人员等[11]对日本、法国、意大利及美国等地区的323个IHNV 株G基因序进行分析，结果表明，核苷酸的最大变异系数是8.6%，系统进化树分析结果表明，北美株形成个基因型(U、M 和L)，分布于3个不同的地理区域，M基因型中最大的核苷酸变异为7.6%，是U和L基因型最大变异系数的2倍多，法国和意大利株属于M基因型，日本株属于U基因型。在本研究中，核苷酸同源性比对显示，CJ-13株G基因与韩国株和日本株同源性最高。从结构基因系统发育树可以看出CJ-13株与韩国和日本分离株的IHNV为同一进化分支。因此预测CJ-13株属于U基因型，可能由韩国株或者日本株变异而来。

[1] S St-Hi LLarie,C S Ribb Le,C Siephen,etal.Epidemio Logica L investigation of infectious hematopoietic necrosis virus in sa Lt water net-pen reared Atlantic salmon in British Columbia,Canada[J].Aquacu Lture,2002,212:49-67.

[2] 赵志壮,牛鲁祺.中国本溪虹鳟一株弹状病毒的分离及初步研究[J].水生生物学报,1994,18(4):348-353.

[3] 刘荭,范万红.国内养殖鱼类和进境鱼卵中传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的检测及基因分析[A].华中农业大学学报，2006,25(5):544-549.

[4] K Wo L f.Infectious hematopoietic necrosis virus.In Fish Viruses and Fish Vira L Diseases[M].Ithaca,NY,Corne LL University Press,1988：83-114.

[5] S St-Hi LLarie,C S Ribb Le,C Siephen.Epidemio Logica L investigation of infectious hematopoietic necrosis virus in sa Lt water net-pen reared Atlantic salmon in British Columbia Canada[J].Aquacu Lture,2002,212:49-67.

[6] Nichol S T,Rowe J E,Winton J R.Molecμlar epizootiology and evolution of the glycoprotein and non-virion protein genes of infectious hematopoietic necrosis virus,a fish rhabdovirus[J].Virus Res,1995,38(2/3):159-173.

[7] Emmenegger E J,Meyers T R,Burton T O,etal．Genetic diversity and epidemiology of infectious hematopoietic necrosis virus in Alaska[J].Dis Aquat Organ，2000 Apr 20;40(3):163-176.

[8] Ammayappan A,Vakharia V N.Molecμlar characterization of the Great Lakes viral hemorrhagic septicemia virus(VHSV)strain from USA[J].Virol J，2009,6:171.

[9] Nishizawa T,Kinoshita S,Kim W S,etal.Nucleotide diversity of Japanese isolates of infectious hematopoietic necrosis virus(IHNV)based on the glycoprotein gene[J].Dis Aquat Org,2006,71(3):267-272.

[10] Arun Ammayappan ，Scott E laPatra,Vikram N Vakharia,etal.Molecμlar characterization of the virμlent infectious hematopoietic necrosis virus(IHNV)strain 220-90[J].Virology Journal，2010,7:10.

[11] Kurath G,Garver K A,Troyer R M,etal.Phylogeography of infectious hematopoietic necrosis virus in North America[J].J Gen Virol,2003,84(4):803-814.

Etiology and whole genome sequence analysis of Infectious hematopoietic necrosis disease virus(IHNV)isolates from epidemic

JIAO Xue1, JI Shang-lei1, ZHANG Pei-jun2, LENG Dong-ze1, MAO An-ting1, LI Yue-hong1

(1.Jilin Agriculture University, College of animal science and technology, Changchun 130118，China 2.Jilin provincial health inspection and Testing Center, Changchun 130118，China)

In order to have a preliminary understanding the pathogenic characteristics of a rainbow trout aquaculture field strain of infectious hematopoietic organ necrosis virus in northeast area,the strains of rainbow trout fry artificial back after experimental infection.The resμlts showed that there were obvious clinical symptoms in the experiment of artificial infection in one week.The mortality of rainbow trout fry polishing filtration sterilization after inocμlation to pantouyu muscle cell line(FHM),the characteristic cytopathic effect(CPE),with six pairs of specific primers of infectious hematopoietic organ necrosis virus(IHNV)4 groups of aquatic animal viruses to the strains of race-PCR,amplifying the fμll-length.The resμlts showed that the total length of the viral genome was 11132 NT,and the contents of 4 nucleotides G,A,C and T were 24.28%,28.67%,19.46%,27.59%,,,respectively.Comparison of the corresponding genes of IHNV strains published in GenBank with mμltiple strains.The resμlts showed that the G gene of the isolates was higher than that of ChYa07 and PcKw11 in South Korea,97.8% and 97.5%,respectively.The resμlts showed that the CJ-13 strain was relatively close to the South Korean and the Japanese strains.

Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; Epidemic etiology; complete sequence Corresponding author：LI Yue-hong

2016-06-15

国家自然科学基金(30972191)；吉林省留学人员创新创业项目(201523)；长春市农业先进实用技术的示范推广项目(20130215)；农业部948项目(2014Z34)

焦雪(1992- )，女，研究生，主要从事动物疾病及免疫研究，E-mail:455261939@qq.com

李月红，E-mail:liyhong@sina.com

S855.3

A

0529-6005(2017)03-0039-04