虹鳟肠道微生物的研究进展

王微微， 余 晓

（1.遵义医学院，贵州遵义563000；2.西南大学资源环境学院，四川重庆400715）

虹鳟肠道微生物的研究进展

王微微1*， 余 晓1，2

（1.遵义医学院，贵州遵义563000；2.西南大学资源环境学院，四川重庆400715）

虹鳟肠道微生物群落是肠道的正常组成部分，与肠道共同构成了具有一定生理功能的微生态系统，在宿主的生长发育、营养代谢、免疫调节和防御等方面发挥了不可替代的作用，对虹鳟的健康生长十分重要。本文对虹鳟肠道微生物的组成及其在营养、屏障和免疫等方面的功能，以及影响肠道微生物的因素进行了综述，旨在为更深入地研究虹鳟肠道微生物提供理论参考。

虹鳟；肠道微生物；多样性；营养代谢；免疫调节

动物体表和体内栖息着种类繁多、数量巨大的微生物，消化道是宿主体内微生物存在最丰富的场所。研究表明，消化道微生物对宿主健康有极其重要的意义，例如，参与营养物质的消化、吸收及能量代谢等（Flint等，2012）。因此，肠道微生物对宿主的影响与健康等之间的关系，已经成为近年来研究的热点。

虹鳟（Oncorhynchus mykiss）属鲑形目，鲑科，大麻哈鱼属，为典型的冷水性鱼类，具有营养丰富、肉质鲜嫩等特点，是全球养殖量最大的鲑科鱼种类（孙大江和王炳谦，2010）。同样地，肠道是虹鳟体内最重要的消化吸收器官，且定植了大量的微生物。虹鳟肠道微生物在宿主生长发育中发挥着重要作用，并且肠道中微生态环境的平衡状态与宿主的健康息息相关。因此，本文对虹鳟肠道微生物群落的组成和多样性，肠道微生物的功能和影响肠道微生物的因素进行了综述。

1 虹鳟肠道微生物组成和数量

鱼类肠道中的微生物由需氧、兼性厌氧和厌氧细菌组成，它们与肠道在长期进化过程中形成一个动态的微生态系统。在开口摄食之前，硬骨鱼的营养来源是鱼卵的卵黄囊，该时期的硬骨鱼肠道是一种未分化的管状结构，且与周围水体相通。Ingerslev等（2014）研究虹鳟发育早期阶段微生物时发现，虹鳟开口摄食前，其肠道中的细菌主要是由水体的土壤杆菌属的种类组成。开口摄食后的第一天，即有一定数量的细菌定植在虹鳟肠道中。伴随着虹鳟开口摄食，细菌在其肠道中定植的丰度和多样性均增多，肠道中的核心菌群由4个门类的细菌组成，即拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门和放线菌门 （Ingerslev等，2014；Desai等，2012；Navarrete等，2012）。

根据微生物在鱼类肠道中定植的位置，鱼类肠道中微生物菌群可以分为固有菌群和过路菌群。固有菌群是指定植在宿主肠道上皮表面或微绒毛上的微生物，而过路菌群则是定植于肠道腔道中，与肠道消化物有关的微生物。较早的研究发现，鱼类肠道中固有菌群的数量比过路菌群的数量少2~3个对数单位 （Spanggaard等，2000）。Merrifield等（2009a；2009b）对养殖的虹鳟肠道中微生物进行分离培养时发现，虹鳟前肠黏膜上细菌的活菌数（约4.8~5.8 log CFU/g）显著地少于前肠内容物中细菌的活菌数 （约6.7 log CFU/g），说明了前肠中固有菌群数量显著地低于过路菌群数量；同样地，后肠黏膜上细菌数量（约5.4~6.1 log CFU/g）也少于后肠内容物中细菌的数量（约6.8 log CFU/g），但差异不显著。通过变性梯度凝胶电泳（DGGE）方法分析了虹鳟肠道黏膜和内容物中细菌的群落结构，发现前肠和后肠的固有菌群与过路菌群在其群落结构中存在显著差异。同样地，Kim等（2007）研究发现虹鳟肠道黏膜上细菌群落的丰度和多样性较肠道内容物均表现出显著性差异。

随着分子生物学技术的发展，越来越多的方法被应用于揭示虹鳟肠道微生物的组成。Huber等（2004）通过FISH（fluorescence in situ hybridization）方法研究了养殖虹鳟肠道内容物的微生物，发现其群落结构主要由以气单胞菌属和肠杆菌科细菌为主的γ变形杆菌亚门构成，其次是不动杆菌属、假单胞菌属等在内的β变形杆菌亚门的细菌以及革兰阳性菌。Etyemez和Balcázar（2015）利用Roche454（GS FLX Titanium System）高通量测序技术对虹鳟肠道黏膜中细菌16S rRNA基因的V1-V3区进行测序和分析，揭示了虹鳟肠道黏膜上丰度最高的细菌类群隶属于不动杆菌属、鲸杆菌属、假单胞菌属和嗜冷杆菌属，而气单胞菌属、梭菌属、黄杆菌属等种类的细菌较少。随后，Lyons等（2015）采用Illumina Miseq高通量测序方法，研究了虹鳟肠道腔道中和肠道黏膜上的细菌多样性，结果发现，γ变形杆菌亚门的细菌是虹鳟肠道细菌群落的优势类群，且该类群在过路菌群和固有菌群的群落组成中所在比例不同，分别是54.3% 和37%。同时，该研究发现虹鳟肠道中固有菌群和过路菌群都由相同的细菌类群构成，但是固有菌群中各细菌类群组成比例更为均衡。此外，虹鳟肠道中很难发现专性厌氧菌的存在，即便检测到专性厌氧菌，其丰度也很低 （Huber等，2004；Lyons等，2015），这说明了鲑科鱼肠道中的优势菌群主要是好氧菌和兼性厌氧菌（RingΦ等，2008）。

2 虹鳟肠道微生物的功能

鱼类肠道微生物在宿主体内发挥了重要作用，是宿主生理系统的一部分，被认为是机体重要的“微生物器官”（O'Hara等，2006）。同样地，肠道微生物在虹鳟的生长和发育中发挥了重要作用，参与了宿主的消化吸收和免疫防御等生理功能。

2.1 营养功能 虹鳟肠道微生物中一些优势类群的细菌具有分泌一系列酶的能力，可以参与到宿主对营养物质的消化过程。比如，虹鳟肠道中优势菌放线菌因可产生多种胞外酶而表现出多样的代谢特性（Ventura等，2007）。Koca等（2015）在虹鳟肠道中分离到了三株具有高效蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的细菌，分别是气单胞菌属、芽孢杆菌属的种类以及柠檬酸杆菌，这就表明了肠道菌群具有提高食物消化率的潜在能力。目前，关于鱼类肠道微生物合成维生素的研究中，以产生维生素B12的报道较多，且合成维生素B12的主要为厌氧微生物（杨彬彬和邵庆均，2013）。Lyons等（2015）发现虹鳟肠道中一些严格厌氧菌可以合成维生素参与到宿主代谢过程中，即丙酸杆菌属和鲸杆菌属的细菌都可以在肠道中合成维生素B12。Navarrete等（2012）在对虹鳟肠道微生物的研究中发现，梭杆菌门中一些种类的细菌具有合成多种维生素的能力。营养物质是鱼类生长的物质基础，微生物在虹鳟肠道内可产生各种消化酶，并可提供维生素等营养物质，具有促进虹鳟消化以及提高其生长性能的潜在作用。

2.2 生物防御功能 正常肠道微生物在维持宿主健康方面发挥的重要作用体现在抵抗病原菌的入侵和定植。正常肠道微生物能够通过产生抗菌物质、与病原菌竞争肠道黏膜上的黏附位点和营养物质、增强宿主抵御病原菌的免疫应答等方式，实现其生物屏障的作用（Sha等，2013；Hempel等，2012；Desriac等，2010）。乳酸菌是虹鳟肠道中常见的一类细菌，具有抗菌活性，可以抵御病原菌的入侵。Balcázar等（2007）研究发现，虹鳟肠道的内生菌乳杆菌通过增强宿主免疫应答来减少因细菌感染造成的虹鳟疖疮病。虹鳟肠道中两种乳酸菌可以作为益生菌来降低虹鳟因格氏乳球菌感染造成的死亡率，主要原因是乳酸菌可以与格氏乳球菌竞争营养以及黏附位点（Vendrell等，2008）。此外，乳酸菌还可以通过合成一些抗菌物质，比如有机酸、过氧化氢或者细菌素等来阻止革兰阳性病原微生物的侵入 （Nes等，2007；Cintas等，2001）。Araújo等（2015）研究发现，从虹鳟肠道中随机筛选的乳酸菌中有71.5%的分离株具有抗菌活性，并且248株细菌可以抵抗至少四种鱼类病原菌的感染，其中88株细菌具有抵抗虹鳟病原菌格氏乳球菌的活性。将从虹鳟肠道中分离获得具有抗菌活性的细菌制备成益生菌制剂，其可作为抗生素的替代品来控制虹鳟疾病，从而减少抗生素的用量。

2.3 免疫调节功能 鱼类的免疫系统由黏膜相关淋巴组织在内的免疫组织和器官、免疫细胞和体液免疫因子组成（张艳秋等，2005）。黏膜是鱼类最先接触病原的部分，是一个重要的物理屏障，并且大量的正常微生物群落定植在黏膜表面，发挥了抵御病原的生物屏障作用。肠道黏膜相关淋巴组织（GALT）在肠道免疫中发挥着重要的调节作用，并且GALT发育成熟与肠道微生物之间有一定联系（Rhee等，2004）。虹鳟肠道中存在着具有潜在益生作用的细菌，可以提高宿主的免疫能力，比如虹鳟肠道中的枯草芽孢杆菌可以增加虹鳟肠道黏膜的溶菌酶活性，刺激机体的细胞和体液免疫应答，有助于增强宿主抗气单胞菌强毒株感染的能力，从而提高了虹鳟的存活率（Newaj-Fyzul等，2007）。Pérez-Sánchez等（2011）将从虹鳟肠道中分离的植物乳杆菌添加至饲料后，投喂虹鳟并同时进行了格氏乳球菌攻毒试验，试验结果显示，在投喂和攻毒过程中，植物乳杆菌可以显著地提高肠道中白细胞介素-8（IL-8）的表达量，此外，该菌也显著地提高了其他免疫相关基因的表达量，表明植物乳杆菌有刺激虹鳟免疫应答的作用。

3 影响虹鳟肠道微生物组成的因素

鱼类肠道中微生物群落结构会因鱼龄、营养条件、环境因素、基因型、肠道不同区域生理结构的差异而表现出不同，并且同种不同个体之间的肠道微生物群落结构也会表现出差异性，即宿主因素和非宿主因素影响了虹鳟肠道微生物组成。

3.1 宿主因素 不同生长发育阶段的虹鳟肠道微生物群落组成有所不同。在虹鳟仔鱼阶段，从肠道中分离的细菌中以气单胞菌科的细菌为主；从稚鱼到幼鱼阶段，肠杆菌科的细菌为虹鳟肠道菌群的主要种类，且数量逐渐增多；到了成鱼阶段，其肠道菌群种类数量增多，虹鳟肠道微生物的主要菌群不仅包括肠杆菌科的细菌，还包括了链球菌科和其他科的细菌 （Araújo等，2015）。此外，Navarrete等（2012）将不同家系的虹鳟随机分组饲养后发现，同一养殖环境中不同家系的虹鳟肠道微生物群落中都拥有独特的细菌种群，表明了不同家系的虹鳟宿主本身决定了其肠道中细菌的组成。

3.2 非宿主因素 饵料是虹鳟肠道菌群组成的主要影响因素。植物粕添加至饵料中可以提供可发酵的碳水化合物，从而改变了肠道菌群的组成比例。将投喂虹鳟的饵料中50%鱼粉换为豆粕后，虹鳟肠道中的嗜冷菌属和酵母菌的数量增加（Merrifield等，2009a）；用植物蛋白替代50%的鱼粉后降低了虹鳟肠道细菌丰度，而且在虹鳟肠道中没有发现拟杆菌门的细菌 （Navarrete等，2012）。Ingerslev等（2014）研究发现，给虹鳟投喂海洋来源的鱼粉时，虹鳟肠道中细菌以变形杆菌门、拟杆菌门和放线菌门的种类为主；而在投喂植物来源的饵料时，虹鳟肠道微生物的主要菌群为厚壁菌门的细菌，并且植物来源的饵料有利于具有抵御病原菌功能的细菌在肠道中的定植。

益生菌是指有益的活性微生物，可通过不同的机制促进鱼类健康和改善环境。益生菌可作为一类微生态制剂被用于鱼类养殖中，在抵抗病原菌、增加机体免疫力方面发挥重要作用。当饲料中添加了益生菌后，也会改变肠道微生物的组成，比如可以提高虹鳟肠道中芽孢杆菌、乳酸菌和肠道杆菌的数量（Alak等，2012）。在饲料中添加2%的酵母菌益生菌，不仅提高了虹鳟的生长性能和抵御病原菌的能力，而且可以显著地增加虹鳟肠道中细菌的数量（Adel等，2016）。

益生元是能够通过选择性地刺激肠道中有益菌的增殖而对宿主发挥有益作用的一类不易消化的物质（Hoseinifar等，2010），主要包括寡糖和多糖类物质。蔡雪峰等（2006）将壳寡糖添加到饲料后投喂虹鳟幼鱼56 d后发现，各试验组的虹鳟肠道优势菌群都发生了改变，肠道菌群多样性降低，其中肠道中的肠杆菌科和假单胞菌属的细菌减少或消失了。在饵料中添加甘露寡糖投喂虹鳟幼鱼60 d后发现，虹鳟肠道菌群中乳酸菌数量发生了改变，并且添加1g/kg甘露寡糖的试验组虹鳟肠道中乳酸菌的数量最多（Denj等，2015）。

鱼类肠道微生物群落中的一些细菌也存在于水体环境中。从鱼类发育早期开始，水体微生物就开始影响鱼类肠道菌群的组成。在不同时间段分别对三个不同养殖场的虹鳟采样和分析后发现，不同采样点的虹鳟肠道微生物群落都有其独特的优势菌群（Huber等，2004）。这说明了不同养殖环境和季节的改变也会影响到鱼类肠道微生物的组成。

4 小结

近年来，肠道微生物已成为一个重要的研究热点。随着分子生物学技术的不断提高，尤其是二代测序技术在虹鳟肠道微生物研究中的应用，为更加深入地探讨虹鳟肠道菌群的功能提供了技术手段。此外，虹鳟肠道微生物群落结构受众多因素影响，加强对虹鳟肠道微生物演替规律的研究，可以更好地调控和管理虹鳟肠道微生物菌群，也为开发虹鳟微生物态制剂提供理论基础，有助于促进虹鳟的健康养殖。

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The intestine of rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）is a complex micro-ecosystem，in which inhabits a large and diverse microbial community.The normal intestinal microbiota，which contributes to rainbow trout growth，and plays a vital role in host nutrition，immunity and disease prevention.In this present review，the composition of intestinal microbiota and their roles in digestion，immunity and disease prevention，as well as the influence factors were summarized. Those might provide references for the further study of intestinal microbiota in rainbow trout.

rainbow trout；intestinal microbiota；diversity；metabolism；immune modulation

S917.1

A

1004-3314（2017）07-0031-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170706

贵州省省市科技合作专项资金项目（省市科合[2015]52号）；遵义市红花岗区科学技术项目（遵红科合社字[2014]05号）

*通讯作者