鉴别犬瘟热病毒强弱毒株SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法的建立

由丛华 ， 张传美 ， 张洪亮 ， 秦志华 ， 杨海燕 ， 单 虎

(1.青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室 ， 山东青岛266109; 2.山东省蓬莱市畜牧局 ， 山东蓬莱 264003)

鉴别犬瘟热病毒强弱毒株SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法的建立

由丛华1,2， 张传美1， 张洪亮1， 秦志华1， 杨海燕1， 单 虎1

(1.青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室 ， 山东青岛266109; 2.山东省蓬莱市畜牧局 ， 山东蓬莱 264003)

为建立犬瘟热强弱毒株SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法，根据GenBank公布的犬瘟热毒株的全基因序列并参考相关文献，选择M基因保守区域合成了1对通用引物M1/M4及鉴别犬瘟热强弱毒株的特异引物M2和M3。试验证明，该方法重复性良好；检测强弱毒株的最低检出限度在10拷贝；对新城疫病毒、水貂肠炎病毒、阿留申病毒、犬腺病毒、犬细小病毒5种病毒的特异性检测均为阴性；对175份犬瘟热疑似病料进行荧光定量RT-PCR，检出127份阳性样品，其中强毒株98份，弱毒疫苗株29份，常规RT-PCR检出112份阳性样品。结果表明，该方法的敏感性高于常规RT-PCR检测，并能有效的鉴别强弱毒株。

犬瘟热病毒 ； SYBR Green I 荧光定量RT-PCR ； 强弱毒株 ； 鉴别

犬瘟热(Canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(CDV)引起的一种犬类高度接触性传染病，可感染犬科、鼬科等多种动物，成为当前危害养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业最大疫病之一。目前传统的诊断方法中[1-2]，胶体金试剂盒检测方法虽然快速，但是准确率低[3]并无法用来区分强弱毒株；常规RT-PCR检测方法存在假阳性、耗时长等缺点[4]。荧光定量RT-PCR技术实现了对模板准确定量，具有特异性强、重复性好和结果直观可定量并能区分强弱毒株等优点，已得到广泛的应用[5]。本研究使用SYBR Green I 荧光定量RT-PCR技术通过特异性引物对犬瘟热强弱毒株进行区分，建立了犬瘟热强弱毒株的SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法，该方法为快速准确的区分犬瘟热强弱毒株提供了有效的检测手段。

1 材料与方法

1.1 毒株、试剂及仪器 犬瘟热野毒株(命名为CDV-Y，H全基因测序为野毒株)1株；犬瘟热弱毒疫苗株(CDV-3株)；新城疫疫苗株(NDV-B1株)；水貂肠炎病毒(MEV)、阿留申病毒(ADV)、犬腺病毒(CAV)、犬细小病毒(CPV)毒株及病料均由山东省预防兽医学重点实验室保存。RNA iso plus，质粒抽提试剂盒，胶回收试剂盒，pMD19-T载体，E.coli、DH5α等，购自宝生物工程(大连)有限公司；荧光定量PCR 仪(Rotor-gene3000)为美国Gene公司。

1.2 引物的设计 根据GenBank公布的犬瘟热毒株的全基因序列并参考相关文献[6]，选择M基因保守区4264～4861 bp间，合成一对通用引物M1和M4(扩增片段为600 bp)。根据强弱毒株间有差别区域，合成位于两对通用引物中的强弱毒株的特异引物M2和M3，M2/M4可特异性扩增强毒株(扩增片段为247 bp)，M3/M4可特异性扩增弱毒株(扩增片段为177 bp)。

M1:5′-AAATCCTGTGTTACCCGCTC-3′；M2:5′-TGGTGGCTCTGCAATATGAA-3′；M3:5′-AATGAATGGATGCCTGGGGTTT-3′；M4:5′-CAAAACTTAGGGTCCAGGAC-3′；1.3 标准品的制备 对强毒株CDV-Y和弱毒株CDV-3提取RNA，进行反转录，以反转录cDNA为模板，用引物M1/M4、M2/M4、M3/M4进行常规RT-PCR，胶回收后连接pMD19-T载体中，转入DH5α获得野毒株和疫苗株的重组质粒并测其质粒浓度，换算为拷贝数作为标准品。

1.4 标准曲线及熔解曲线的绘制 分别以M2/M4为强毒株上下游引物，以M3/M4为弱毒疫苗株上下游引物，将犬瘟热强弱毒株标准品按照107～101倍比稀释作为模板，25 μL的反应体系为：SYBR Primix ExTaq12 μL、0.1 nmol/L强弱毒株上、下游引物各1 μL；质粒标准品稀释的模板1 μL、无菌水10 μL。最佳反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35个循环。溶解曲线分析温度为78 ℃～95 ℃。经软件分析后得到犬瘟热强弱毒株标准曲线和熔解曲线。

1.5 敏感性、特异性及重复性试验 用强弱毒株拷贝数依次为1.0×107～1.0×101copies/μL进行SYBR Green I荧光定量RT-PCR，进行敏感性试验；分别对强弱毒株质粒标准品与NDV、MEV、ADV、CAV、CPV的cDNA，分别用引物M2/M4和M3/M4进行单一荧光定量RT-PCR 检测，确定该方法的特异性试验；分别取强弱毒株的1.0×102、1.0×104、1.0×106三个稀释度标准品，进行组内及组间的重复性试验，并且计算组内及组间的变异系数。

1.6 临床样品检测 对采集的175份由胶体金试剂检测阳性疑似犬瘟热病料，研磨为组织悬液并提RNA后用Oligo DT反转录为cDNA，分别用引物M2/M4和M3/M4对病料进行SYBR Green I 荧光定量RT-PCR检测，同时用通用引物M1/M4进行常规RT-PCR检测。

2 结果

2.1 PCR结果及标准品的制备 犬瘟热强毒株(CDV-Y)和弱毒疫苗(CDV-3)的PCR产物分别出现大小为600 bp、247 bp和177 bp的条带，与预期的目的条带的大小相一致(图1)。分别对目的条带胶回收纯化，连接转化后提取质粒，质粒经过PCR鉴定为目的条带。

图1 犬瘟热强弱毒株PCR产物

M： DL-1 000 DNA Marker； 1：强毒株CDV-Y； 2：弱毒株CDV-3疫苗株； 3：阴性对照

图A：引物M1/M2分别扩增强弱毒株条带； 图B：引物M2/M4和M3/M4分别扩增强弱毒株条带

2.2 荧光定量PCR方法的建立 建立强、弱毒株标准曲线呈现良好的线性关系，相关系数分别为R2=0.998和R2=0.996。动力学曲线显示，强弱毒株的Tm值分别在78 ℃±0.5 ℃和79 ℃±0.5 ℃，强弱毒株均无引物二聚体及非特异扩增峰。

2.3 敏感性试验 强弱毒株的荧光定量RT-PCR的最小检测量均为101，标准曲线在 l07-101呈现较好的线性关系(见中插彩版图2)。

2.4 特异性试验 建立的单一荧光定量PCR均能检测出强弱毒株，而对NDV、MEV、ADV、CAV、CPV无阈值信号产生(见中插彩版图3)。结果表明，该方法在强弱毒株检测中有很好的特异性。

2.5 重复性试验 选取1.0×102、1.0×104、1.0×106三个稀释度标准品作为模板对两套引物进行批间和批内测试，结果表明，两套引物的变异系数均小于2%，说明其重复性良好(表1)。

表1 强弱毒株批内及批间重复性试验

2.6 临床样品检测 应用建立的强弱毒株SYBR Green I 荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR，对175份犬瘟热疑似病料进行检测。荧光定量RT-PCR共检出阳性样品127份，其中强毒株98份，弱毒疫苗株29份；常规PCR仅检出阳性样品112份。临床检测证明建立的荧光定量RT-PCR具有更高的敏感性。

3 讨论

目前，疫苗是预防和治疗犬瘟热最有效的方法，被广泛应用于毛皮动物养殖及宠物饲养和野生动物保护等领域，但由于野毒株变异的长期积累，CDV疫苗株可能已经不能对所有的CDV流行株产生有效的保护，这可能是导致免疫失败的主要原因之一，另外近几年来经常有免疫的犬或水貂暴发犬瘟热的现象发生。

为了鉴别犬瘟热强毒株还是疫苗株对动物的感染，YiLi等[7]人通过对CDV H基因氨基酸的比对发现，在331位和502位氨基酸残基上存在差异从而设计野毒株与疫苗株PCR鉴别引物，杨天阔等[10]人通过比对野毒株与疫苗株H基因设计特异性引物，建立用于鉴别检测CDV野毒株与疫苗株的RT-LAMP检测方法。这些方法虽然能够区分强弱毒株，但在灵敏度方面与荧光定量PCR检测方法相比存在一定的差距[9]。虽然现在已有关于建立荧光定量PCR检测犬瘟热病毒的方法，但并未有荧光定量PCR检测方法对强弱毒株进行鉴别区分。本研究通过CDV强弱毒株特异性引物，优化反应条件，建立了区分强弱毒株的SYBR Green I 荧光定量检测方法。通过验证该方法敏感性、特异性和重复性良好，闭管检测无需PCR后处理，避免了样品间的交叉污染，临床检测效果良好，说明本方法可广泛用于毛皮动物养殖业及宠物饲养和野生动物保护等领域强弱毒株临床检测中，及时区分强弱毒株感染，指导疫苗使用和药物使用情况。

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[2] 张鸿，胡传莉，翟晓虎．犬瘟热病毒单抗夹心ELISA检测方法的建立[J]．扬州大学学报，2011，12：4-32．

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[5] Perpinán D，Ramis A. Tomás A，etal. Outbreak of canine distemper in domestic ferrets (Mustela putorius furo) [J]. Vet Rec, 2008,163:246-250.

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[9] 苏建青. 犬瘟热免疫层析试纸及荧光定量PCR诊断方法的建立与评价[D].长春:吉林大学,2008.

Development of a SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR assay for detection and identification wild-type and vaccine strain of canine distemper virus

YOU Cong-hua1，2, ZHANG Chuan-mei1, ZHANG Hong-liang1, QIN Zhi-hua1，YANG Hai-yan1, SHAN Hu1

(1.Shandong Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China； 2.The Livesfock Bureau of Penglai at Shandong Province, Penglai 264003, China)

SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR was developed for the detection and identification of wild-type and vaccine strains of canine distemper virus(CDV).According to the differences of whole gene sequence of M gene in the strains of CDV in Genebank, two pairs of primers, universal primer M1 and M4 and specific primers M2 and M3 were designed to differentiate wild-type and vaccine strain of CDV. The developed RT-PCR could detect minimum 10 copies for wild-type and vaccine strains and specifically differentiate NDV,MEV,ADV,CAV,and CPV. SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR and normal PCR detected 127 positive samples and 112 positive samples,respectively. Twenty-nine positive samples were vaccine strain in 127 positive samples detected by SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR. This results show that the sensitivity of this assay is higher than normal RT-PCR, which can also differentiate wild-type and vaccine strains of CDV.

Canine distemper virus; SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR; wild-type and vaccine strain; identification.

s：ZHANG Chuan-mei； SHAN Hu

2014-12-31.

公益性行业(农业)科研专项(201303042)；科技基础性工作专项(科技部)(2012FY111000)

由丛华(1989-)，男，硕士，研究方向为动物传染病防治，E-mail: youconghua@163.com

张传美，E-mail:zhangchuanmei100@163.com；单虎，E-mail:shanhu67@163.com

S852.65+5

A

0529-6005(2017)03-0023-03