猪流行性腹泻病毒山西分离株M基因序列分析

刘文俊 ， 王娟萍 ， 姚敬明 ， 吴 忻 ， 孟 帆 ， 韩一超 ， 李红丽 ， 樊振华 , 米瑞娟 ， 薛翼鹏

(山西省农业科学院畜牧兽医研究所 ， 山西太原030032)

猪流行性腹泻病毒山西分离株M基因序列分析

刘文俊 ， 王娟萍 ， 姚敬明 ， 吴 忻 ， 孟 帆 ， 韩一超 ， 李红丽 ， 樊振华 , 米瑞娟 ， 薛翼鹏

(山西省农业科学院畜牧兽医研究所 ， 山西太原030032)

为了研究山西地区猪流行性腹泻病毒M基因的遗传变异情况，从2014年10月～2015年4月山西地区11个地市收集的猪流行性腹泻病毒(PEDV)病料中扩增到4株PEDV 的M基因，并进行序列比对及遗传分析。结果表明，4株PEDV 的M基因与CV777毒株比较，部分核苷酸及氨基酸发生改变。4株PEDV的M基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.6%～100%和99.1%～99.6%，与参考毒株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为96.3%～99.9%和96.0%～99.1%。遗传进化分析显示，4株PEDV与2010-2013年中国分离株(BJ2010、HB/BD、HB/FN、HLJ-2012、GDHZ-1202、SHQP/YM/2013)、2008年泰国KU04RB08株亲缘关系较近；与2株泰国株(M_NIAH2013_95和M_NIAH1795_04)、2株欧洲株(CV777和Br1/87)和2006年中国分离株LZC亲缘关系较远。

猪流行性腹泻 ； 山西分离株 ； M基因 ； 序列分析

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪的一种急性、高度传染性肠道传染病，临床上以呕吐、水样腹泻和脱水死亡为特征[1-2]。该病1978年首次报道于比利时和英国[3-4]，1984年宣化等证实该病在我国存在[5]。猪流行性腹泻病毒是冠状病毒科、冠状病毒属的成员，为有囊膜单股正链RNA病毒，基因组全长约28 k，包括5′端非编码区、3′端非编码区以及至少7个开放阅读框(ORF1a、 ORF1b、ORF2-ORF6)[6-7]。其中，由ORF5基因编码的M蛋白在病毒粒子组装、出芽过程中起重要作用，同时能诱导中和抗体的产生[8]。为了调查山西地区PEDV M基因的遗传变异情况，本研究通过RT-PCR方法对2014-2015年采集自山西省11个地市的PEDV阳性病料的M基因进行了克隆测序和序列分析，以便为我省防控PED提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 病料 病料于2014-2015年采集自山西省太原、晋中、吕梁等11地市发生仔猪腹泻的猪场，包括小肠及肠内容物等。

1.2 病料的处理 将采集的小肠及肠内容物剪碎后研磨，加入PBS缓冲液匀浆后，12 000 r/min(4 ℃)离心5 min，收集上清液，-80 ℃保存备用。

1.3 主要试剂 RNAiso Plus、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PremixTaqTM、DNA Marker DL-2 000、pMD18-T Vector，购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；E.coliDH5α菌株，购自天根生化科技(北京)有限公司；乙醇、异丙醇、氯仿等试剂均为分析纯。

1.4 引物的设计与合成 根据GenBank登录PEDV CV777 M基因保守区设计了扩增M基因全序列的引物，扩增产物片段预期长度为689 bp。引物序列如下：M-F：5′-AACGAAATATGTCTAACGGTTCTATTC-3′，M-R：5′-TTAGACTAAATGAAGCACTTTCTCAC-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5 病毒RNA的提取 按RNAiso Plus试剂盒操作说明书，从阳性病料中提取病毒基因组RNA，用适量的DEPC水溶解，-20 ℃保存，备用。

1.6 M基因的扩增、克隆和测序 提取的RNA为模板制备cDNA，参照PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit操作说明书进行。在PCR管中依次加入，RNase free H2O 7 μL、RNA 1 μL 、dNTP 1 μL，反转录引物(M-R)1 μL；混匀后，65 ℃保温5 min后，冰上迅速冷却；在上述的PCR管加入5 PrimeScript II Buffer 4 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、 PrimeScript Ⅱ RTase 1 μL、 RNase free dH2O 4.5 μL。PCR反应体系：PremixTaq25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，灭菌蒸馏水21 μL，混匀后进行扩增。扩增反应条件：94 ℃ 预变性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃45 s，72 ℃ 60 s，35个循环；再 72 ℃ 延伸10 min。取10 μL PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。将PCR产物纯化后与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，经鉴定后将阳性菌液送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.7 序列分析 对所获得的4株PEDV M基因序列用DNAStar软件与GenBank中登录的12株国内外分离株的M基因进行了同源性分析，并构建进化树。

2 结果

2.1 PEDV M基因的扩增结果 从阳性病料中提取 RNA， 用引物M-F和M-R进行RT-PCR扩增，分别获得4个与预期片段大小相符的特异片段(图1)，分别命名为：CH/SXHF18/2015、CH/SXTLF10/2015、CH/SXCH11/2015和CH/SXJZY11/2015。

图1 PEDV M基因的扩增结果

2.2 M基因序列变化 4株PEDV山西分离株M基因全长均为689 bp，无核苷酸插入和缺失。与CV777 M基因相比，4株PEDV山西分离株M基因有13个相同的核苷酸突变，分别为：37为核苷酸由G→C，125、285、618位由T→C，180位由G→A，198、213、222、234、566位由C→T，348位由T→A，603位由A→C，640位由G→T。另外，CH/SXTLF10/2015株在453位由A→G、503位由T→A，CH/SXHF18/2015株在273位由G→T。4株PEDV山西分离株M基因推倒的氨基酸与CV777相比，第13位氨基酸由E→Q，第42位由V→A，第189位 A→V，第214位由A→S。另外，CH/SXTLF10/2015株的第168位氨基酸由F→Y。

2.3 M基因同源性分析 4株PEDV山西分离株M基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.6%～100%和99.1%～99.6%。与GDHZ～2012、KU04RB08、SHQP YM2013、BJ2010、HB-BD、HB/FN、HLJ-2012核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.0%～99.9%和97.4%～99.1%。与Br1/87、LZC、CV777核苷酸和氨基酸的同源性分别为96.8%～98.1%和95.6%～97.8%。与M_NIAH1795_04、M_NIAH2013_95核苷酸和氨基酸的同源性分别为96.3%～96.8%和96.0%～96.5%。

2.4 M基因的遗传进化分析 将获得的M基因与GenBank已发表的PEDV的M基因进行核苷酸序列比对，利用MEGA4构建进化树，见图2。由图2可知，PEDV毒株可分为3个群。4株PEDV山西分离株均属于第3群，同属该群的还有1986-2013年的13株中国株(CH/S、LJB-03、JS-2004-2、DX、CH/HNCH/06、BJ2010、HB/BD、HB/FN、SH1、HLJ-2012、GDYA、GDHZ-1202、SHQP/YM/2013)，1997-2009年6株韩国株(KPEDV-9、Chinju99、M2227、PFF188、CPF259、DR13)，2008年泰国株泰国KU04RB08和日本株JMe2。欧洲株CV777、Br1/87和中国2006年分离到LZC株组成第2群。泰国1995年分离的M_NIAH2013_95和2004年分离的M_NIAH1795_04组成第1群。遗传进化分析表明，4株PEDV山西分离株与2010-2013年中国分离株(BJ2010、HB/BD、HB/FN、HLJ-2012、GDHZ-1202、SHQP/YM/2013)、2008年泰国KU04RB08株亲缘关系较近；与2株泰国株(M_NIAH2013_95和M_NIAH1795_04)、2株欧洲株(CV777和Br1/87)和2006年中国分离株LZC亲缘关系较远。

图2 基于PEDV M基因绘制的进化树

3 讨论

3.1 2010年10月，中国南方暴发PED[9]，给养猪业造成巨大经济损失。2014年冬季至2015年春季，山西省部分规模化猪场暴发哺乳仔猪腹泻病，临床主要表现为哺乳仔猪水样腹泻、严重脱水和呕吐，发病率和死亡率高达90%～100%，给我省养猪业造成巨大的经济损失。为了查清山西省猪流行性腹泻的流行情况，课题组对山西11个地市的30个规模化猪场的仔猪腹泻发病情况进行了流行病学调研，并对采集的253份病料进行猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)检测，PEDV阳性率为73.26%，TGEV阳性率为7.36%。表明山西省猪群发生的腹泻，主要是由猪流行性腹泻病毒引起。3.2 4株PEDV山西分离株M基因有13个相同的核苷酸突变。另外，CH/SXTLF10/2015株有2个位点，CH/SXHF18/2015株有1个位点发生了不同于其他毒株的核苷酸突变。4株PEDV山西分离株M基因推倒的氨基酸与CV777相比，有4个相同位点的氨基酸发生突变。另外，CH/SXTLF10/2015株的第168位氨基酸由F→Y。4株PEDV山西分离株M基因与郑逢梅等[10]、黄冬妮等[11]、卢冰霞等[12]分离的毒株有不同的突变点，可能是在选择压力下发生了一定的变异，因此，课题组计划进一步分析PEDV其他遗传变异情况，为预防控制PED提供参考。

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Sequence Analysis of the M Gene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus in Shanxi Province

LIU Wen-jun , WANG Juan-ping ， YAO Jing-ming ， WU Xin , MENG Fan ， HAN Yi-chao , LI Hong-li , FAN Zhen-hua ， MI Rui-juan , XUE Yi-peng

(Institution of Animal Husbandry and Veterinary, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030032, China)

In order to study the heritable variation of M gene of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in Shanxi Region, 4 PEDV field strains were isolated from 11 cities in Shanxi province during October 2014 to April 2015.M gene was amplified from the 4 PEDV field strains by RT-PCR, cloned, sequenced and compared with the other reference strains in GenBank. The result showed that the several nucleotides and amino acids of M gene of 4 PEDV field strains compared with the vaccine strain (CV777) changed. The nucleotide and amino acid homologies of M gene of the 4 PEDV field strains in Shanxi were 99.6% to 100% and 99.1% to 99.6%, respectively, but compared with the reference strains were 96.3%-99.9% and 96.0%-99.1%. Phylogenetic analysis showed that the 4 PEDV strains had closer genetic relationship with the Chinese isolates (BJ2010, HB/BD, HB/FN, HLJ-2012, GDHZ-1202, SHQP/YM/2013) during 2010 to 2013 and Thailand isolate (KU04RB08) in 2008, but more distant genetic relationship with European isolate (CV777,Br1/87), Thailand isolates (M_NIAH2013_95, M_NIAH1795_04) and China isolate (LZC) in 2006.

porcine epidemic diarrhea virus ; Shanxi isolates ; M gene ; sequence analysis Corresponding author:WANG Juan-ping

2016-05-12

山西省科技攻关项目(20140311020-2-A);山西省科技攻关项目(20150311018-3)

刘文俊(1979-)，男，助理研究员，硕士，主要从事动物疫病分子生物学检测与诊断技术的研究，E-mail：774075120@qq.com

王娟萍，E-mail:jcbyjs@sohu.com

Q785

A

0529-6005(2017)03-0032-03