植物甾醇在不同基质饮料中的储藏稳定性研究

杨 开,王玏萦,徐梦婷,孙培龙

(浙江工业大学 海洋学院,浙江 杭州 310014)

植物甾醇在不同基质饮料中的储藏稳定性研究

杨 开,王玏萦,徐梦婷,孙培龙

(浙江工业大学 海洋学院,浙江 杭州 310014)

将乳化后的植物甾醇按相同添加量加入到牛奶、果汁和果汁乳饮料中,在4, 20, 35 ℃条件下恒温保存三个月,每隔一个月测定三种饮料中植物甾醇氧化物(POPs)和植物甾醇的质量分数.实验结果表明:储藏期结束后,35 ℃条件下保存的牛奶中POPs质量分数最多,达(997.09±26.48) μg/g,甾醇损失率达(25.50±1.03)%,4 ℃保存的果汁乳饮料中的POPs质量分数最少,为(237.65±16.48) μg/g,甾醇损失率为(2.95±0.37)%.以牛奶为基质的饮料中的POPs质量分数最多,其次是果汁,果汁乳饮料最少.将三种含植物甾醇的饮料在室温下置于光照和避光条件下保存,储藏期结束后,光照组中的POPs质量分数均明显大于避光组.

植物甾醇;饮料;氧化产物;储藏稳定性

植物甾醇是存在于植物中的一种天然物质,其结构和胆甾醇类似[1].常见的植物甾醇主要有β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等.研究表明:每天服用2 g植物甾醇可以降低血液中10%低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)[2],此外植物甾醇还具有抗炎、抗氧化、抗癌、防止心血管疾病等多种生理活性,被国际生命科学学会大力推荐为十大功能性食品配料之一[3].目前,植物甾醇已被广泛应用于人造奶油、乳制品、焙烤制品、香肠、植物油、果汁等食品中[4],其中由于植物功能性饮料市场巨大,越来越多的国家对植物甾醇饮料进行了研究,美国可口可乐饮料公司开发生产了添加植物甾醇成分的柑橘汁产品[5],英国TESCO集团在英国市场推出了降胆固醇乳制品,意大利EI公司开发了名为Sauscol Bianco的含植物甾醇的益生菌饮料[6],植物甾醇在功能性饮料的开发和应用中起着越来越重要的作用,添加植物甾醇的功能性饮料正形成一股新兴的健康热潮.

天然植物甾醇在在光、热、氧气或酶等作用下,会发生自身氧化或酶促氧化形成甾醇氧化物(POPs).植物甾醇氧化物的种类主要分为主环氧化物和侧链氧化物,一般会生成含羟基、酮基、环氧基和三羟基等结构的主环氧化物[7].这些氧化产物会影响到功能性饮料的营养价值,而目前我国对植物甾醇在食品中稳定性的研究和应用主要集中在油脂,因此,探究含有植物甾醇功能性饮料的储藏稳定性是十分必要的.利用植物甾醇制备功能性乳饮料,研究了三种基质的饮料在不同储藏温度、储藏时间和光照条件(光照、避光)下POPs质量分数的变化,旨在为功能性饮料的开发应用提供理论基础和科学根据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物甾醇:实验室自制,纯度为(93.73±1.06)%,主要成分及相对质量分数,豆甾醇47.35%,β-谷甾醇32.36%,菜油甾醇15.18%,24-亚甲基胆甾醇5.11%;牛奶(脱脂):市购;鲜榨果汁(橙子、苹果):实验室自制;果汁乳饮料(脱脂乳加鲜榨果汁):实验室自制;5α-胆甾烷:美国Sigma公司;正己烷、乙醚:分析纯,杭州双林化工试剂厂;色谱级正己烷:阿拉丁试剂(上海)有限公司.

1.2 仪器与设备

Thermo Scientific气相色谱质谱联用仪:型号Thermo ISQ单四极杆,美国Thermo Fisher Scientific公司;超高温瞬时灭菌机:PT-20T型,上海沃迪科技有限公司;打浆机:SKG1354,佛山艾诗凯奇电器有限公司;电热恒温培养箱:DRP-9002,上海森信实验仪器有限公司;固相萃取仪:W-SPE 12,北京莱伯泰科仪器股份有限公司;氮吹仪:HN200(24孔),济南海能仪器股份有限公司;双光束紫外可见分光光度计,TU-1900,北京普析通用仪器有限责任公司.

1.3 实验方法

1.3.1 植物甾醇乳液的制备

称取三聚甘油单硬脂酸酯和蔗糖脂肪酸酯(质量比为1∶2)的混合乳化剂于烧杯中,量取去离子水倒入烧杯配成质量分数为5%的乳液,在70 ℃条件下用磁力搅拌器搅拌至完全溶解并形成水相.将油菜花粉甾醇缓慢加入水相,配成质量分数为8%的甾醇乳液,用高速剪切机均质形成水包油型甾醇粗乳液.乳化后的乳状液一般以众多分散的粒子形式存在,因此需采用高压均质机在75 MPa条件下进行均质后得到水包油型甾醇乳液.

1.3.2 样品的制备

由于植物甾醇不溶于水,因此将植物甾醇乳化后加入饮料中,配制成油包水型甾醇乳液.

分别在脱脂乳、果汁和果汁乳饮料中加入甾醇乳液,制备成含有5 g/L植物甾醇的功能性饮料,将三种样品置于超高温瞬时灭菌机中115 ℃灭菌热处理15 s,灭菌后在无菌条件下将样品放入无菌带盖的无色透明玻璃试剂瓶中.

1.3.3 储藏条件对甾醇稳定性影响

制备得到含有植物甾醇的功能性饮料分别在以下条件下存放,每隔一个月取样测定其甾醇和甾醇氧化物的质量分数,研究不同存放条件下甾醇的稳定性.储藏温度:三种不同基质的含有甾醇的饮料分别放置在4, 20, 35 ℃的恒温培养箱中.光照试验:将三种不同基质的含有甾醇的饮料分别在室温(25 ℃左右)20 W白炽灯和避光条件保存.

1.3.4 内标液的制备

精确称取50 mg 5α-胆甾烷,用色谱级正己烷溶解并定容于100 mL的容量瓶中,混匀,制备得到质量浓度为0.5 mg/mL的内标液.

1.3.5 固相萃取分离富集甾醇氧化物(POPs)

先用正己烷活化固相萃取小柱,将样品溶解在体积比为9∶1的正己烷和乙醚的混合液中,随后倒入萃取柱.在真空抽滤的条件下,加入体积比为9∶1的正己烷-乙醚混合液,用离心管收集,待溶液完全流下后,再加入体积比为1∶1的正己烷-乙醚混合液[8].加入7 mL丙酮洗脱除去氧化物,5α-胆甾烷为内标,加入到洗脱液中.

将含有POPs的丙酮溶液用氮吹仪氮气吹干并加入100 μL无水吡啶和100 μL BSTFA(含1%的TMCS)混合溶液,在室温下放置4 h后氮气吹干,重新溶于色谱级正己烷待进一步的分析.

1.3.6 气相色谱-质谱(GC-MS)定性分析饮料中POPs

由于POPs的标准品市面上无法购得,但为了分析储藏期间饮料中的POPs,在实验室模拟甾醇的氧化条件,将豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇和24-亚甲基胆甾醇进行热氧化,GC-MS鉴定POPs,具体的氧化条件和GC-MS方法参考文献[9].

氧化步骤:取10 mg植物甾醇标准品,在180 ℃烘箱中加热氧化3 h,冷却即得植物甾醇氧化物.

饮料中的POPs质量分数采用GC-MS测定[10],测定条件如下:

1) 气相色谱条件.毛细管柱:TG-5MS柱(30 m×0.25 mm,0.32 μm);升温程序:起始温度160 ℃,保持1 min,以40 ℃/min升至270 ℃,保持1 min,然后以4 ℃/min升至280 ℃,保持25 min.进样口温度为300 ℃;载气流速1.0 mL/min;分流比为20∶1.

2) 质谱条件.电子轰击离子源(EI),电子能量70 eV,离子源温度200 ℃,接口温度300 ℃,扫描质量范围100～650 Da.各组份经过与标准品对照及NIST 2.0标准谱库检索相匹配,确定POPs的组成成分.

1.3.7 定量分析饮料中POPs

饮料中的POPs质量分数采用内标法,以5α-胆甾烷为内标,7β-羟基豆甾醇氧化物为标准品建立标准曲线(y=0.090 7x-0.001 6,x为标样浓度,y为标样峰面积与内标峰面积之比,相关系数R2=0.994 3,POPs质量分数以7-羟基氧化物计.

1.3.8 饮料中植物甾醇质量分数的测定

植物甾醇与硫酸发生反应产生颜色,不同种类的植物甾醇只是C-17支链的结构不同,发生反应的显色基团相同,因此采用磷硫铁显色法[11]测总甾醇的质量分数.

制作标准曲线得到线性方程为y=6.646 9x-0.010 7,其相关系数R2=0.997 8.

称取一定量的样品,用无水乙醇溶解后定容至容量瓶中.根据样品数量不同,取不同数量的试管,分别加入样品溶液、无水乙醇和磷硫铁显色剂各2 mL,使用漩涡振荡仪使其均匀,15 min之后使用分光光度计在520 nm处测其吸光值,样品总甾醇含量计算公式为

式中:m为样品吸光度对应的豆甾醇量,μg;V为定容体积,mL;B为稀释倍数;M为样品重量,mg.

植物甾醇的损失率计算公式为

甾醇损失率=

1.3.9 数据处理

试验数据均以origin 8.5软件处理,以SPSS 13.0软件进行统计分析,每组试验重复3次,取其平均值.

2 实验结果

2.1 GC-MS测定植物甾醇氧化后POPs的组成

植物甾醇的氧化主要是由于甾醇结构上的烯丙基上的氢原子不稳定,易丢失变成自由基,与氧分子形成7α-氢过氧化物和7β-氢过氧化物,这两种化合物不稳定生成7α-羟基化合物和7β-羟基化合物.7α-羟基化合物和7β-羟基化合物脱氢以及氢过氧化物脱水生成7-酮基化合物.六元环上的双键也不稳定,易与氧气反应生成环氧化物.

羟基化合物植物甾醇经过热氧化后生成POPs,将POPs硅烷化处理后进行GC-MS分析鉴定,得到POPs的总离子流图如图1所示.由图1可知:甾醇氧化后生成13种POPs,主要的POPs衍生物出峰时间如表1所示.

图1 POPs的GC-MS总离子流图Fig.1 GC-MS ion flow chromatogram of POPs

序号保留时间/minPOPs类型125．67β⁃epoxystigmasterol229．48α⁃epoxystigmasterol329．65β⁃epoxysitosterol432．51α⁃epoxysitosterol533．077⁃ketostigmasterol635．287⁃ketocampesterol735．727α⁃hydroxycampesterol836．857α⁃hydroxysitosterol937．717α⁃hydroxystigmasterol1038．267β⁃hydroxycampesterol1139．217β⁃hydroxystigmasterol1239．797β⁃hydroxysitosterol1340．927β⁃hydroxycholeserol

2.2 不同储藏温度下各饮料中POPs质量分数的变化

2.2.1 牛奶中POPs质量分数的变化

甾醇的氧化机制和不饱和脂肪酸氧化机制类似,即启动了一个自动催化的自由基链式反应[12],其氧化降解机制遵循自由基氧化机制[13].POPs由于受到热作用的影响,诱导形成自由基攻击甾醇环结构中的双键而生成[14].

图2 不同储藏温度下牛奶中POPs质量分数的变化 Fig.2 Changes of POPs in milk at different storage temperatures

由图2可知:在储藏期间,随着温度的升高,POPs增加量更为显著(P<0.05),储藏结束后,存放在温度为35 ℃条件下的牛奶中POPs的质量分数由(198.14±26.29) μg/g增加至(997.09±26.48)μg/g,放置在20 ℃条件下的牛奶中POPs的质量分数增加至(802.75±32.03) μg/g,4 ℃条件下的牛奶中POPs的质量分数增加至(415.22±11.91) μg/g.

2.2.2 果汁中POPs质量分数的变化

由图3可知:35 ℃储藏条件下,果汁中POPs质量分数增加明显(P<0.05),由最初的(181.50±5.91)μg/g上升至(736.00±17.84) μg/g,20 ℃条件下果汁中的POPs质量分数增加至(631.40±22.99)μg/g,4 ℃条件下的果汁中POPs的质量分数为(346.98±13.64) μg/g.

图3 不同储藏温度下果汁中POPs含量的变化 Fig.3 Changes of POPs in fruit juice at different storage temperatures

储藏期结束后,果汁中的POPs质量分数相对于牛奶中的少,可能是由于果汁中的多酚具有抗氧化作用,抑制了植物甾醇发生氧化反应,也可能与牛奶的热处理相关,在早期的美拉德反应过程中形成了氧分子,进而诱导牛奶中的促氧化剂活性增加[15].

2.2.3 果汁乳饮料中POPs质量分数的变化

由图4可知:在果汁乳饮料中,POPs增加量仍然与温度存在显著关系(P<0.05),即储藏温度越高,果汁乳饮料中POPs的增加量越多.当温度为35 ℃时,储藏期结束后果汁乳饮料中的POPs由(190.46±7.03) μg/g增加至(626.04±23.79) μg/g,储藏温度为20 ℃时POPs增加至(501.29±7.94) μg/g,储藏温度为4 ℃时,POPs质量分数增加至(237.65±16.48) μg/g.

图4 不同储藏温度下果汁乳饮料中POPs质量分数的变化 Fig.4 Changes of POPs in juice-milk beverage at different storage temperatures

但果汁乳饮料中POPs的质量分数增长量较牛奶和果汁基质中的少,这可能是由于果汁中的多酚类物质与牛奶相互作用,维持了在热加工处理过程中甾醇的抗氧化能力.

2.3 不同储藏温度对各饮料中植物甾醇损失率的影响

由表2可知:植物甾醇在各饮料中的损失率与储藏温度有关,即温度越高甾醇的损失率越高.储藏期结束以后,4 ℃条件下保存的果汁乳饮料中的植物甾醇的损失率最低,而35 ℃条件下保存的牛奶中的植物甾醇的甾醇损失率最大.

表2 不同储藏温度各饮料中植物甾醇的损失率

续表2

2.4 光照对不同基质饮料中POPs质量分数的影响

由图5可以看出:在储藏期内,光照和避光储藏的饮料中POPs变化差异较大,储藏期结束以后,光照组POPs质量分数显著高于避光储藏组(P<0.05),由此可见,光照对于植物甾醇在饮料中的氧化程度有很大的影响,且避光储藏时饮料中的POPs生成量明显少于光照储藏.因此,含甾醇的功能性饮料应储存在避光条件下,或者在选择包装材料时应选择不透光的容器.

图5 光照对不同基质饮料中POPs质量分数的影响 Fig.5 Effects of light on the content of POPs in different matrix

3 结 论

含有植物甾醇的三种不同基质的饮料在不同的温度下保存,每隔一个月测定饮料中植物甾醇的质量分数,并固相萃取纯化POPs,利用GC-MS测定饮料中的POPs质量分数.结果显示:随着储藏时间的增加,POPs的质量分数亦增加,植物甾醇的损失率增加,且低温有利于保持植物甾醇的稳定性,其中以果汁乳饮料为基质的植物甾醇储藏稳定性最好,果汁次之,牛奶最差.光照试验结果显示:避光保存能较好保持各饮料中植物甾醇的稳定性,能够在一定程度上抑制POPs的生成.因此,含有植物甾醇的功能性饮料应在低温下保存,以果汁乳饮料为基质,在选择包装材料时应选择避光的容器.本研究结果可为含有植物甾醇的功能性饮料的科学储存提供指导,同时也为今后功能性饮料的开发和应用提供思路.

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(责任编辑：朱小惠)

Storage stability of phytosterol in beverages of different matrix

YANG Kai, WANG Leying, XU Mengting, SUN Peilong

(College of Ocean, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Equivalent amount of emulsified phytosterols were added into the milk, fruit juice and juice-milk beverage. All the beverages were stored at 4, 20, 35 ℃ for three months and the content of phytosterol oxidation products (POPs) and phytosterol were determined at regular time every other month. The results showed that the contents of POPs in milk were the highest, followed by fruit juice and juice-milk beverage. The highest contents of POPs in the milk stored at 35 ℃ were (357.09±26.48) μg/g, the losses of total phytosterol were (25.50±1.03)% after three months, and the lowest contents of POPs in the juice-milk beverage stored at 35 ℃ were (237.65±16.48) μg/g and the losses of total phytosterol were (2.95±0.37)%. The three beverages of different matrix containing phytosterols were stored at room temperature under light and dark conditions, respectively and the contents of POPs in the light group were significantly higher than that in the dark group.

phytosterol; beverages; oxidation products; storage stability

2017-02-11

浙江省科技厅植物食品创新团队项目(2012R10032-09)

杨 开(1978—),男,浙江奉化人,副研究员,研究方向为食品化学与资源利用,E-mail:yangkai@zjut.edu.cn.

TS201.2

A

1674-2214(2017)01-0006-05