牛乳中嗜冷菌的PCR快速检测

楼 坚,申雨珂,刘梦云,靳羽晓,叶剑钦,尤玉如,毛建卫,刘士旺

(1.浙江科技学院 生化学院/轻工学院,浙江 杭州 310023;2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室,浙江 杭州 310023; 3.浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心,浙江 杭州 310023)

牛乳中嗜冷菌的PCR快速检测

楼 坚1,2,3,申雨珂1,2,3,刘梦云1,2,3,靳羽晓1,2,3,叶剑钦1,2,3,尤玉如1,2,3,毛建卫1,2,3,刘士旺1,2,3

(1.浙江科技学院 生化学院/轻工学院,浙江 杭州 310023;2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室,浙江 杭州 310023; 3.浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心,浙江 杭州 310023)

利用选择性培养基分离牛乳中的嗜冷菌,通过形态学特征观察和生理生化试验鉴定分离株,判断分离株为杆菌属和球菌属.根据菌属基因序列设计PCR引物,提取基因组DNA进行PCR快速检测,通过测序比对确定分离株为嗜冷杆菌和腐生葡萄球菌.

牛乳;嗜冷菌;PCR

嗜冷菌污染是大规模液态乳工业化生产面临的难题.大多数嗜冷菌在低温贮藏时产生耐热性的胞外蛋白酶,这些酶能耐受巴氏消毒甚至UHT处理,使乳产生凝胶、沉淀、苦味和酸败等现象,并影响产品色泽,导致乳及乳制品风味、质地变异,保质期缩短,从而影响乳产品质量及加工过程的顺利进行[1-2].

不同地区和不同的奶牛饲养方法等都对牛乳中嗜冷菌种类和数量具有一定的影响.要减少嗜冷菌的危害,早期对原料乳中嗜冷菌的检测和控制是关键.但当前国内外尚无统一的标准,也没有快速的检测方法.目前,嗜冷菌的检验大多采用传统粗放的方法,即在5～7 ℃培养10 d后计数.该方法的缺点是费时费力,对操作技术的要求高,在实际生产中存在严重滞后的问题,往往是检测尚未完成,原料奶已是成品,有的或许已进入市场.由于乳制品为保鲜类产品,生产周期短,大多在10 d以内,巴氏杀菌奶则更短,一般在2～3 d内,因此建立一种快速鉴定检测嗜冷菌的方法十分必要[3-4].笔者研究了乳品中微生物嗜冷菌的分离和快速鉴定方法,对开展嗜冷菌快速检测,有效控制嗜冷菌对原料奶和乳制品的危害,提高乳制品质量和安全具有一定的理论和实际意义.

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 试剂及仪器

氯仿,杭州高晶精细化工有限公司;异戊醇,上海凌峰化学试剂有限公司;无水乙醇,安徽安特生物化学有限公司;十二烷基磺酸钠,广东汕头西陇化工厂;十六烷基三甲基溴化铵,上海伯奥生物科技有限公司;Tris,上海思吉生物制品有限公司;乙二胺四乙酸二钠,天津顶福化工总厂;2,3,5-氯化三苯基四氮唑,上海华东师范大学化工厂;质粒提取试剂盒,AXYGEN;紫外透射分析仪,上海精科实业有限公司;PCR仪,杭州博日科技有限公司.

1.1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨固体培养基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,氯化钠5 g,琼脂15～20 g,水1 000 mL;pH 7.0～7.2,121 ℃灭菌20 min.

CVT固体培养基:酵母膏2.5 g,蛋白胨5.0 g,葡萄糖1.0 g,结晶紫0.001 g,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.05 g,琼脂15～20 g,水1 000 mL,pH 6.0,121 ℃灭菌20 min.

甲基红试验液体培养基:蛋白胨5 g,葡萄糖5 g,K2HPO45 g,水1 000 mL,pH 7.0～7.2,每试管分装4～5 mL,121 ℃灭菌20 min.

肉汁胨液体培养基:牛肉浸膏3 g,蛋白胨10 g,水1 000 mL,pH 7.0～7.2,121 ℃灭菌20 min.

淀粉培养基:在肉汁胨固体培养基中加0.2%可溶性淀粉,121 ℃灭菌20 min.

硝酸盐还原试验液体培养基:肉汁胨液体培养基1 000 mL,KNO31 g,pH 7.0～7.6,每试管分装4～5 mL,121 ℃灭菌20 min.

吲哚试验液体培养基:1%胰胨水溶液,pH 7.2～7.6,分装1/4～1/3试管,121 ℃灭菌20 min.

1.2 方 法

1.2.1 样品乳中嗜冷菌的分离方法

采用稀释涂布与划线分离结合的方法,分离纯化牛乳中的嗜冷菌后进行革兰氏染色镜检及生理生化试验.

1) 稀释:取1 mL样品乳和9 mL无菌水于无菌空三角烧瓶中稀释混匀.

2) 涂布培养:取0.1 mL稀释样品乳涂布在牛肉膏蛋白胨和CVT平板培养基表面,在4,15,20 ℃培养箱中倒置培养,挑取单菌落,分离纯化培养,标注菌种来源、培养时间和温度.

1.2.2 分离株的系统鉴定方法

单菌落分离纯化数次后,挑取菌落细胞进行革兰氏染色镜检,并进行生理生化试验(接触酶试验、甲基红(M.R)试验、V-P测定、硝酸盐还原试验)[4].

1) 接触酶试验:以铂丝接种环取一小环培养24 h的分离株斜面菌种,涂抹于已滴有3%过氧化氢的玻片上,如有气泡则为阳性,无气泡为阴性.

2) 甲基红(M.R)试验:将分离株菌种接种于甲基红(M.R)试验液体培养基中,室温下培养2～6 d(如为阴性可适当延长培养时间).培养后,在培养液中加入一滴甲基红试剂,红色为阳性,黄色为阴性.

3) V-P测定:接种和培养方法同甲基红(M.R)试验.培养后,将培养液和40%氢氧化钠等量混合.加少许肌酸,反应10 min,如红色为阳性,无色为阴性.

4) 淀粉水解试验:取分离株斜面菌种接种于淀粉培养基上,室温培养2～5 d,形成明显菌落后,滴加碘液.菌落周围呈不变色透明圈为阳性,无透明圈为阴性.

5) 硝酸盐还原试验:将分离株斜面菌种接种于硝酸盐还原试验液体培养基中,室温下培养1,3,5 d,另做空白对照.在干净的空试管或在比色瓷盘小窝中倒入培养液并加一滴格里斯氏(Griess)试剂A液及B液.溶液如变成粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等表示亚硝酸盐存在,为硝酸盐还原阳性反应.如无红色出现,则继续加1～2滴二苯胺试剂,此时溶液呈蓝色表明培养液中有硝酸盐,无硝酸盐还原作用,为硝酸盐还原阴性反应;如不呈蓝色表明硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他物质,故仍应按硝酸盐还原阳性反应处理.

6) 吲哚试验:将分离株斜面菌种接种于吲哚试验液体培养基中,室温下培养1,2,4,7 d.培养后,沿管壁缓慢加入3～5 mm高的吲哚试剂于培养液表面,在液层界面产生红色为阳性,无红色为阴性.

1.2.3 基因组DNA的快速提取

目前实验室中采用的细菌DNA的提取方法有多种,主要有沸水法、酚-氯仿法、试剂盒法、Chelexl00法、CTAB/NaCl法等[5].本实验采用试剂盒法.

引物序列:根据文献[6]报道,利用软件进行引物设计,如表1所示.

表1 ISR引物序列

PCR反应:根据扩增条带的强弱改变反应体系和反应条件,重复扩增反应[7],建立20 μL的PCR最佳体系和条件,如表2所示.

表2 PCR反应体系1)

注:1) 反应条件为变性95 ℃,3 min;后35个循环为94 ℃,30 s,56 ℃,30 s，72 ℃,70 s;后延伸72 ℃,10 min.

电泳和成像:将样品液进行琼脂糖凝胶电泳,EB染色20～25 min,拍摄并观察染色后的凝胶电泳图像.

DNA回收:采用EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit过柱回收DNA.

测序:由上海英骏生物技术有限公司完成.

2 结果与讨论

2.1 嗜冷菌的分离鉴定

分离株在牛肉膏蛋白胨培养基上生长特征为乳白色或湿土色,透明或半透明,表面光滑,边缘平滑整齐;在CVT选择性培养基上生长菌落特征为红色,呈高粱米粒大小,革兰氏染色后镜检阳性和阴性均有.嗜冷菌在20 ℃下培养1～2 d有可见菌落生成;在15 ℃下培养3～5 d有可见菌落生成;在4 ℃下培养7～10 d有可见菌落生成.生理生化实验鉴定如表3所示,查阅手册判断为以杆菌属和球菌属为主[4].

表3 嗜冷菌培养特征、镜检和生理生化反应结果

2.2 PCR反应体系和反应条件的建立

对#02,#05和#06分离株应用ML-ISR-F/ML-ISR-R引物分别在不同退火温度下扩增,以建立最佳PCR反应体系,结果如图1所示.图1中上样(从左至右)为-CK,Mark,#02.1,#02.2,#02.3,#05.1,#05.2,#05.3,#06.1,#06.2,#06.3.结果表明:在56 ℃退火温度下,PCR扩增条带最好.选定56 ℃为退火温度,重复PCR扩增反应进行验证,结果见如图2所示,图2中上样(从左至右)为Mark,#02.1,#02.2,#02.3,#05.1,#05.2,#05.3,#06.1,#06.2,#06.3，可见#05和#06扩增条带大小相同,与#02有显著差异.#06.1出现杂带,可能由于基因组污染.

图1 分离株在不同退火温度下PCR扩增凝胶电泳成像图Fig.1 The gel electrophoresis image for PCR amplification of the isolates at different annealing temperatures

2.3 测序比对结果

对分离株16S RNA扩增后测序,对比图谱如图3～5所示.从图3比对图谱上可以看出:#02分离株16S RNA序列与已公布的Staphylococcus

图2 分离株PCR扩增凝胶电泳成像图 Fig.2 The gel electrophoresis image for PCR amplification of the isolates

saprophyticussub sp.SaprophyticusATCC 15305 DNA序列同源性极高(96%),可能是葡萄球菌属的腐生葡萄球菌.该菌株未在相关嗜冷菌研究文献报道中出现,即可能是乳样品在取样过程中受污染,也可能存在于乳样品中.实验中,它能在低温下生长,且在CVT培养基上生良好,其嗜冷性有待进一步研究与确证.从图4,5比对图谱上可以看出:#05和#06分离株16S RNA序列高度同源,且与已公布的Psychrobacterarcticus373-4 16S RNA序列同源性最高(88%).结合其培养特征和系统鉴定结果,确定#05和#06分离株为嗜冷杆菌属(Psychrobactersp.).若要进行属种的详细鉴定,可参照文献[8]的相关方法.

图3 #02分离株基因序列比对图谱Fig.3 The map of #02 isolates gene sequence alignment

图4 #05分离株基因序列比对图谱Fig.4 The map of #05 isolates gene sequencing alignment

3 结 论

嗜冷菌在工业生产、食品加工、环境保护等与人类生活息息相关的领域都有着广泛的应用和广阔的发展前景.虽然大多数嗜冷菌在贮存时会产生耐受巴氏消毒甚至超高温(UHT)瞬时灭菌处理的酶类(蛋白酶和脂肪酶),这将影响乳制品工业的发展.但嗜冷菌的特殊性质,使其在工业生产的诸多领域有着相当大的应用优势,如低温下催化反应可防止污染(同源的嗜温酶不活泼),经过温和的热处理即可使嗜冷酶的活力丧失,因此低温或适温处理不会影响产品的品质[9].近年来有关低温微生物的研究日益增多,相信随着研究的持续深入以及生物工程技术的充分利用,低温微生物在生物技术及生命科学研究中的地位将会越来越重要[10].因此,若能对嗜冷菌进行深入研究,则既能有效地控制有害嗜冷菌,又能积极地应用有益嗜冷菌.

图5 #06分离株基因序列比对图谱Fig.5 The map of #06 isolates gene sequencing alignment

[1] 唐兵,唐晓峰.嗜冷菌研究进展[J].微生物学杂志,2002,22(1):51-53.

[2] 吴石金,何光华.原料乳嗜冷菌分离株微生物学特征研究[J].中国乳品工业,2005,33(8):4-6.

[3] 王克新,房玉国.液体乳中嗜冷菌数的测定[J].中国乳品工业,2001,29(5):31-32.

[4] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.

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[7] 李德葆,周雪平.基因工程操作技术[M].上海:上海科学技术出版社,1996.

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[9] 何光华,吴石金.原料乳嗜冷菌的危害分析及控制[J].中国乳品工业,2006,34(8):33-36.

[10] 郭德军,孙爱民,纪振杰.原料乳中嗜冷菌及其主要热稳定性酶类的研究进展[J].中国乳品工业,2006,34(8):46-48.

(责任编辑：朱小惠)

PCR rapid detection of psychrophilic bacteria in cow’s milk

LOU Jian1,2,3, SHEN Yuke1,2,3, LIU Mengyun1,2,3, JIN Yuxiao1,2,3, YE Jianqin1,2,3, YOU Yuru1,2,3, MAO Jianwei1,2,3, LIU Shiwang1,2,3

(1. School of Biological and Chemical Engineering/School of Light Industry, Zhejiang University of Science and Technology, Hangzhou 310023, China; 2. Zhejiang Provincial Key Lab for Chem&Bio Processing Technology of Farm Product, Hangzhou 310023, China; 3. Zhejiang Provincial Collaborative Innovation Center of Agricultural Biological Resources Biochemical Manufacturing, Hangzhou 310023, China)

Psychrophilic bacteria were isolated from the cow’s milk by CVT selective medium, and the isolated strains were identified as bacillus and coccus through morphological observation and common physiological and biochemical experiment. It was further identified asPsychrobactersp. andSaprophyticussub sp. by PCR rapid detection with primers designed according to gene sequence.

Cow’s milk; psychrophile; PCR

2016-10-11

国家级大学生创新创业训练计划(201311057009);浙江省教育厅科研项目(Y201224264);浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心开放基金(2016KF0032);浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室开放基金(2013KF034)

楼 坚(1980—),男,浙江杭州人,讲师,研究方向为生物工程、工业微生物,E-mail:loujianzust@126.com.通信作者:刘士旺教授,E-mail:shiwangliu@163.com.

Q93

A

1674-2214(2017)01-0036-06