四川藏区松栎林下牛肝菌资源及其系统发育研究

［KH－*3D］陈诚，李强，李小林，熊川，金鑫，李萍，黄文丽*

(1．四川省农业科学院生物技术核技术研究所四川成都610066;2．四川省农业科学院土壤肥料研究所四川成都610066)

四川藏区松栎林下牛肝菌资源及其系统发育研究

［KH－*3D］陈诚1，李强1，李小林2，熊川1，金鑫1，李萍1，黄文丽1*

(1．四川省农业科学院生物技术核技术研究所四川成都610066;2．四川省农业科学院土壤肥料研究所四川成都610066)

为了解四川藏区松栎林下牛肝菌资源的系统发育地位，采用形态学和ITS序列分析相结合的方法，对采集于7个地区的11株牛肝菌进行了系统地研究。结果表明，11株牛肝菌形态有所差异，系统发育结果显示它们属于琥珀乳牛肝菌(Suillus placidus)、乳牛肝菌(Suillus bovinus)、褐环乳牛肝菌(Suillus luteus)、绿盖粉孢牛肝菌(Tylopilus virens)、金黄柄牛肝菌(Boletus auripes)、Boletus bainiugan和尚不能确定到属的牛肝菌。研究结果表明，四川藏区松栎林下牛肝菌资源丰富，对该区域的牛肝菌资源的探索具有广阔的前景。

藏区;松栎林;牛肝菌

牛肝菌是对一类真菌的统称，在我国，邓叔群先生首先对牛肝菌进行研究，他在《中国的真菌》中记录了国内的35种牛肝菌［1］。我国的西南地区，包括四川、云南、西藏、贵州等地的牛肝菌资源最为丰富［2］。牛肝菌中大部分为可食用种类，含有丰富的微量元素和必需氨基酸，具有丰富的营养价值。以美味牛肝菌为例，它香浓味美，每百克干菇中含蛋白质20g、脂肪4．0 g，含有全部20种氨基酸、多种微量元素和维生素［3］。目前牛肝菌的新种也不断被发现［4－5］，牛肝菌研究前景广阔。四川藏区牛肝菌资源丰富，松栎林下多为松茸资源产地，生境特殊，也不乏丰富的牛肝菌资源。朱小强等［6］对松栎林土壤表层、根际及土壤剖面上土壤的有机质、全氮、速效氮进行研究发现，松栎林有富积养分的效应，能积累有机质，有利于改善土壤肥力。张艳秋等［7］对西藏藏区和云南藏区牛肝菌资源进行系统发育研究，收集到29种牛肝菌资源，其中拟定新种2个。对于四川藏区特别是松栎林牛肝菌资源的研究尚无系统的研究报道。

本研究牛肝菌的采集地主要分布于凉山州普格县的3个乡镇、德昌县、冕宁县、阿坝州理县的两个乡镇松栎林下，海拔跨度为1863～3021 m，该地区具有独特的气候和地貌条件，通过对该区域内的牛肝菌资源进行系统发育研究，能够了解该地区牛肝菌资源的分布特点，丰富牛肝菌资源库，为牛肝菌的开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1．1 样品采集

2014年7 月从四川藏区凉山州和阿坝州各县的松栎林下采集牛肝菌样品，具体样品编号和对应的采集地点见表1。

表1 样品及采样地位置Table 1Plants sample and the locations of sampling sites

1．2 牛肝菌生境调查及形态学鉴定

首先对牛肝菌的生态因子进行调查，包括林地类型、坡向、海拔、土壤类型等。然后参照李小林等［8］方法对牛肝菌子实体鲜品进行形态特征描述。

1．3 子实体DNA的提取

将牛肝菌子实体用无菌蒸馏水洗净后，再用75 %的乙醇清洗3次，然后用无菌蒸馏水清洗干净，再采用OMEGA Fungal DNA提取试剂盒对牛肝菌子实体进行DNA提取。提取完成后用1．0%琼脂糖凝胶电泳检测，合格样品置于－20℃保存备用。

1．4 牛肝菌ITS扩增及测序

选用真菌通用引物ITS1和ITS4对牛肝菌子实体DNA进行扩增，其引物序列如下:ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')，ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'):反应体系(30 μl):Mix缓冲液(天根生化，北京)15 μl，引物(10 μmol/L)各0．5 μl，模板DNA为1 μl，ddH2O补足至30 μl。PCR扩增条件为:94℃5 min;94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，30个循环;72℃10 min;PCR完成后用1．0%琼脂糖凝胶电泳检测，电压100 V，电泳时间为20 min。PCR产物检测合格后，将目的条带进行切胶纯化，纯化样品送至上海生物工程有限公司进行测序。

1．5 系统发育分析

将牛肝菌样品的测序结果在美国生物技术研究中心(National Center for Biotechnology，NCBI)数据库中进行BLAST比对，在GenBank中寻找同源性最大的序列，采用Neighbor-joining法构建系统发育树［9］。

2 结果与分析

2．1 各牛肝菌生境及子实体形态

由图1可看出，所有采集的牛肝菌样品的大小、形状、颜色等存在较大差异，其生境有所不同。

由表2可看出，各牛肝菌样品生长的环境各不相同，有松树林、栎林，也有松栎混交林，既存在于干燥的环境，也存在于湿润的环境，土壤类型有粘土和砂土。牛肝菌的子实体形态也有较大区别，菌盖颜色、菌盖表面的特征、菌柄的颜色、菌肉的颜色有较大的区别。在相似的生境条件下的牛肝菌外形特征有一定的相似性，如SAAS18-35、SAAS18-39和SAAS18-40都处于栎林下，环境干燥，土壤为砂土，它们的表面为角质，和湿润环境下的牛肝菌有较大区别。

2．2 系统发育分析

从图2可以看出，所有牛肝菌分为2个大簇，簇Ⅰ包含SAAS18-18、SAAS18-3、SAAS18-6、SAAS18-15、SAAS16-23和SAAS16-25共6株牛肝菌。其中SAAS18-18、SAAS18-3和SAAS18-6的亲缘关系较进，SAAS18-18和SAAS18-3和琥珀乳牛肝菌(Suillus placidus)聚在一起，SAAS18-6与它们有一定的差异;SAAS18-5与乳牛肝菌(Suillus bovinus)聚在一起，同源性高达100%;SAAS16-25与褐环乳牛肝菌(Suillus luteus)聚在一起，SAAS16-23和它们整体聚为一个分支，但同时与不可培养菌根菌(Uncultured mycorrhizal)相似性更大。

图1 牛肝菌子实体Fig．1Fruiting bodies of boletes

表2 牛肝菌样品生境及子实体形态Table 2Habitats and fruit bodies of boletes sample

簇Ⅱ中包含SAAS18-39、SAAS18-35、SAAS18-19、SAAS18-22和SAAS18-40共5株牛肝菌，其中SAAS18-39与绿盖粉孢牛肝菌(Tylopilus virens)聚在一起，同源性高达100%;SAAS18-35与牛肝菌科的一株参比菌株聚在一起，尚不能确定种类;SAAS18-19与金黄柄牛肝菌(Boletus auripes)聚在一起，同源性为99%;SAAS18-22和SAAS18-40与Boletus bainiugan聚在一起，其中SAAS18-40与参比序列的亲缘性更大，SAAS18-22和它们有一定的差异。

从整个系统发育树可看出，四川藏区松栎林下牛肝菌资源丰富，种类各异，大部分可确定所属的种类，一部分种属尚不明确，还需要进一步研究。

图2 四川藏区松栎林下牛肝菌ITS序列构建的系统发育树Fig．2Phylogentic tree constructed by boletes ITS in pine oak forest in Tibetan of Sichuan province

3 讨论与结论

四川藏区松栎林地势辽阔，土壤条件和生态环境特殊，很多牛肝菌是具有经济价值的药食两用真菌，因此，开展对四川藏区松栎林牛肝菌资源的调查具有重要的意义。

从牛肝菌子实体形态和生境的分析结果可以看出，在湿润环境下的较多牛肝菌表面也湿润;所有环境干燥，土壤为砂土的牛肝菌表面干燥且为角质，这与湿润环境下的牛肝菌有较大区别。鲁永新［10］等对楚雄州的野生食用菌生境和气候进行分析，总结出野生食用菌在子实体收获盛期热量和降水适中，且变幅小。说明牛肝菌品种与环境有较强的对应关系，具体机制需进一步研究。

从牛肝菌系统发育结果可看出，采集的牛肝菌样品属于琥珀乳牛肝菌(Suillus placidus)、乳牛肝菌(Suillus bovinus)、褐环乳牛肝菌(Suillus luteus)、绿盖粉孢牛肝菌(Tylopilus virens)、金黄柄牛肝菌(Boletus auripes)、(Boletus bainiugan)。有对于琥珀乳牛肝菌(Suillus placidus)的研究发现，从中提取的粘盖牛肝菌素是人体肝癌HepG2细胞有效的细胞凋亡诱导剂，为新抗癌剂的选择提供了参考［11］。乳牛肝菌(Suillus bovinus)是一种可食用的牛肝菌，有研究表明，它的提取物对木霉病原菌具有抗菌活性，可作为抗菌化合物的备用选则［12］。褐环乳牛肝菌(Suillus luteus)是一种食药兼用的牛肝菌，有研究发现，它含有胆碱(choline)及腐胺(putrescine)等生物碱，具有抗癌作用［13］。绿盖粉孢牛肝菌(Tylopilus virens)是一种可食用的牛肝菌，有对该属牛肝菌菌丝发酵液成分分析的研究表明，其含有对大多数需氧腐生植物病原菌具有显著作用的小奥德蘑素，应用前景广阔［14］。黄柄牛肝菌也是一种可食用的牛肝菌，其子实体中等至较大，菌肉厚，是林区常见的牛肝菌品种［15］。从聚类结果可以看出，采自于德昌县和冕宁县的两株牛肝菌与Boletus bainiugan和Boletus meiweiniuganjun，这两株菌是Bryn T．M在超市中购买到的来自于中国的牛肝菌干品，Bryn T．M证实这两株菌是未被发现的新种，进而进行鉴定和命名［16］。可见，四川藏区松栎林下牛肝菌资源种类各异，应用前景广阔。

［1］邓叔群．中国的真菌［M］．北京:科学出版社，1963．

［2］邓百万，陈文强，刘开辉，等．美味牛肝菌的研究现状及应用展望［J］．中国食用菌，2012，31(4):8－11．

［3］李泰辉，宋斌．中国食用牛肝菌的种类及其分布［J］．食用菌学报，2002，9(2):22－30．

［4］Li Yan-chun，Feng Bang，Yang Zhu L．Zangia，a new genus of Boletaceae supported by molecular and morphological evidence［J］．Fungal Diversity，2011，49:125–43．

［5］Halling R E，Nuhn M，Fechner N A，et al．Sutorius:a new genus for Boletus eximius［J］．Mycologia，2012，104(4):951－961．

［6］朱小强，张亚雯，王英宏，等．秦岭山区油松纯林与松栎混交林下土壤养分状况分析［J］．辽林林业科技，2007(4):33－34．

［7］张艳秋．藏区牛肝菌资源及其系统发育树的构建［D］．吉林农业大学，2014．

［8］李小林，郑林用，黄羽佳，等．一株野生朱红硫黄菌的鉴定及系统发育研究［J］．西南农业学报，2014，27(5):2086－2089．

［9］Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al．MEGA5:molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance and maximum parsimony methods［J］．Molecular Biology and Evolution，2011，28(10):2731－2739．

［10］鲁永新，杨海抒，杨永生，等．楚雄州野生食用菌气候生境分析［J］．中国农学通报，2015，31(6):172－179．

［11］LIU Fei-yan，LUO Ke-wang，YU Zhi-ming，et al．Suillin from the mushroom Suillus placidus as potent apoptosis inducer in human hepatoma HepG2 cells［J］．Institute of Cancer Research，2009，181 (2):168－174．

［12］Mucha J，Zadworny M，Werner A．Cytoskeleton and mitochondrial morphology of saprotrophs and the pathogen Heterobasidion annosum in the presence of Suillus bovinus metabolites［J］．US National Library of Medicine National Institutes of Health，2009，113(9):981－990．

［13］卯晓岚．中国大型真菌［M］．郑州:河南科学出版社，2002．

［14］汤建国，任福才，刘吉开，等．绿盖粉孢牛肝菌发酵液化学成分研究［J］．天然产物研究与开发，2009，21:428－429．

［15］樊则郁，樊国盛，邓莉兰．思茅市翠云区主要非木材林产品资源研究［J］．中国林副特产，2006(3):66－68．

［16］Bryn T M，Dentinger，Laura M Suz．What’s for dinner?Undescribed species of porcini in a commercial packet［J］．Peer J．，2014 (2):570．

(责任编辑 陈虹)

Resources of Boletes in Pine Oak Forest in Tibetan of Sichuan Province and Their Phylogenetic Relationship Construction

CHEN Cheng1，LI Qiang1，LI Xiao-lin1，XIONG Chuan1，JIN Xin1，LI Ping1，HUANG Wen-li1*
(1．Institute of Biological＆Nuclear Technology，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 610066，China;2．Soil and Fertilizer Research Institute，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 610066，China)

In order to understand the phylogenetic position of boletes in pine oak forest in Tibetan of Sichuan province，the morphological and ITS sequencing methods were used to systematically study the eleven strains of boletes from seven places．The results showed that the shapes of the eleven strains of boletes had differences，which were phylogenetically categorized into Suillus placidus，Suillus bovinus，Suillus luteus，Tylopilus virens，Boletus auripes，Boletus bainiugan and unknown boletes which could not be identified to genus level．It was conclude that the resources of boletes in pine oak forest in Tibetan of Sichuan province was rich．It is prospective for us to explore resources of boletes in this area．

Tibetan;Pine oak forest;Boletes

S567．3

A

1001－4829(2017)1－0183－05

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．031

2015－04－20

四川省科技支撑计划项目(2013NZ0029＆2014FZ00 04)

陈诚(1991－)，男，四川宜宾人，硕士研究生，主要研究方向为植物微生物资源与利用，E-mail:598506100@qq．com，电话:18200353183，*为通讯作者。