基于脂质组成的滩涂贝类优质饵料微藻筛选和应用

陈文笔， 徐继林， 周成旭， 严小军

(宁波大学 海洋学院， 宁波 315211)

基于脂质组成的滩涂贝类优质饵料微藻筛选和应用

陈文笔， 徐继林， 周成旭， 严小军

(宁波大学 海洋学院， 宁波 315211)

饵料微藻的种类和营养组成影响着贝类的营养、生理与繁殖。为了深入了解微藻饵料对双壳贝类繁育的影响，建立了完整的针对微藻和贝类脂类结构的高灵敏度、结构信息高清晰的液质联用技术，并以此为基础建立了针对不同发育阶段的不同贝类，选择性投喂不同微藻饵料的苗种繁育模式；同时，通过从天然海域分离纯化单细胞微藻，根据脂类营养成分分析并结合实际饵料效果，筛选出2种(3株)适宜贝苗不同阶段摄食的新型高效饵料微藻，填补了贝类苗种培育行业阴雨季饵料供给的缺口，实现了大规格稚贝饵料的高通量连续供给。

滩涂贝类; 饵料微藻; 脂质营养；筛选；应用

我国滩涂可养面积超过100万hm2，滩涂贝类产量名列世界第一，年总产量已突破1000万t，约占海水养殖总量的75%，是我国水产品的重要组成部分。但随着沿海水域生态环境恶化，滩涂贝类天然苗种资源衰退严重，同时伴随养殖规模的不断扩大，贝类苗种的需求量也日益增大，90%以上贝类苗种必须源于人工培育。

滩涂贝类育苗成败关键有两点：水质和饵料。水质受到地理环境、气候变化、经济生活的影响，人为调控能力弱；新鲜活体微藻饵料是双壳类幼虫和稚贝的最佳饵料[1]，虽然非活性饵料和人工配合饲料有所发展，但微藻仍是大部分贝类育苗场双壳贝类养殖的唯一合适食物源[2]，而微藻饵料的选择和培养全程人为可控。在贝类繁育的过程中，幼贝的淘汰率远远高于成贝，故贝类的幼苗期成为贝类繁育的瓶颈阶段。除了水质条件的影响外，常规饵料面临以下两大挑战：首先，2006年以前，我国贝类苗种大多来源于天然捕捞，早期人工育苗种类只有泥蚶(Tegillarcagranosa)单一品种。随着近年来海域环境的日益恶化，绝大多数天然苗种匮乏，目前人工育苗的贝类品种已经包括泥蚶、毛蚶(Scapharcasubcrenata)、缢蛏(Sinonovaculaconstricta)、硬壳蛤(Mercenariamercenaria)、彩虹明樱蛤(Moerellairidescens)、越南白文蛤(Meretrixlyrata)、菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、青蛤(Cyclinasinensis)、文蛤(Meretrixmeretrix)、厚壳贻贝(Mytiluscoruscus)等几乎所有的东南沿海常规养殖品种，贝类苗种繁育种类培育时间已经覆盖全年，但是不同品种的贝类育苗均使用相似的现有常规饵料微藻种类，而这些微藻营养无法完全适合所有幼贝正常发育，无法保证在雨季顺利扩繁并缺少高速扩繁品种，难以满足规模化大规格贝类苗种繁育需求。另外，我国海水养殖苗种培育行业已经超过30年没有推出过饵料微藻新种株，现有的饵料微藻种株适应环境的能力越来越弱，实际培育过程中平台期越来越短，很难满足实际规模化育苗过程中庞大的微藻饵料需求量。急需筛选并储备更多的营养全面或互补饵料微藻新种株，在实际生产中能够在不同培养温度条件、不同天气或不同水质状况下，均能选择到高繁殖速度且营养优异的饵料微藻。为此，宁波大学海洋学院微藻饵料产业团队通过多年的努力，从天然海域分离纯化单细胞微藻，根据脂类营养成分分析并结合实际饵料效果，筛选出2种(3株)适宜贝苗不同阶段摄食的新型高效饵料微藻，填补了贝类苗种培育行业阴雨季饵料供给的缺口，实现了大规格稚贝饵料的高通量连续供给，并已经在滩涂贝类苗种培育行业得到规模化应用。

1 饵料微藻脂质营养学基础研究

研究表明不同饵料微藻对不同滩涂贝类饵料营养效果不同[3]，Rivero-Rodríguez等发现不同微藻对贝类的饵料效果的差别跟微藻的碳水化合物、蛋白质以及总脂含量没有相关性，而认为在稚贝阶段需要适当的脂质营养平衡[4]。所以，该研究主要关注微藻的脂质营养组成对贝类幼苗生长的影响。

早期研究表明，微藻的脂肪酸和甾醇的组成直接决定微藻对贝类的饵料效果，所以，早在2004年，就利用气相色谱-质谱联用分析系统，建立了微藻中脂肪酸和甾醇的连续分析方法[5]；而由于游离脂肪酸对微藻正常的繁殖和对环境响应有着重要的影响[6]，但微藻中游离脂肪酸含量往往很低，常规的脂肪酸分析方法满足分析的灵敏度，故通过把游离脂肪酸样品经五氟苯甲基溴(PFBBr)衍生后进行气相色谱质谱联用分析，建立海洋微藻体内及其培养液中游离脂肪酸的更高灵敏度分析方法[7]。利用这些方法，在26种海洋微藻中共鉴定出40种脂肪酸，并通过对它们的聚类分析，分析结果与现行国际通用的海洋微藻的分类结果相吻合[8]；而通过对29种微藻甾醇的分布研究，共检测到47种甾类化合物，鉴定出36种甾醇和一种甾酮，并根据甾醇结构的不同，将海洋微藻中的甾醇分为4大类别，分别是4位无甲基5位不饱和甾醇、4位无甲基5位饱和的甾(烷)醇、4-甲基甾(烷)醇与含双羟基的甾醇[9]。

由于在实际微藻体内游离脂肪酸很少，绝大部分脂肪酸均以酰基形态存在于甘油酯和鞘脂中，故采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱 (UPLC-Q-TOF-MS) 技术，建立了完整的针对微藻脂类结构的高灵敏度、结构信息高清晰的液质联用技术，得到了海洋微藻脂类组学水平上的定性定量信息。利用在国际上首次建立的海洋微藻中光合作用脂全面分析的方法，从1株硅藻中就可以鉴定出16种单半乳糖甘油二酯(MGDG)、9 种双半乳糖甘油二酯(DGDG)、23种混合硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)和8种磷脂酰甘油(PG)的精确结构[10]；而通过建立的微藻中甘油磷脂的分析方法，在新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)中鉴定出18种脂质成分，包括7种磷脂酰胆碱(PC)，2种磷脂酰乙醇胺(PE)，2种磷脂酰肌醇(PI)和7种磷脂(PG)[11]。针对微藻中甘油三酯的准确识别，利用质谱分析技术成功解决了液质分析甘油三酯过程中共流出物的定性分析，可以更真实反映微藻中甘油三酯的分布组成[12]。而通过对微藻中鞘脂进行详细的组成分析，从3株骨条藻中鉴定出2种新型鞘脂，这种分析手段可成为微藻化学分类的又一可靠的辅助工具[13]。

在以上工作的基础上，通过对基于实际脂类分子组成的饵料微藻全脂成分分析，发现不同饵料微藻的脂质组成明显不同[14]。虽然同一纲的微藻有着近似的脂肪酸组成，但是不同种微藻在实际脂类分子组成上也有着极大的差异[15]，即使是分离自不同地域的同一种微藻，其脂质组成也会有明显不同[16-17]，而哪怕是同一株微藻，在其不同培养阶段，脂质组成也会有明显改变[18-19]。

食物的风味会直接影响生物的摄食选择，为进一步研究贝类对微藻的选择是否受到微藻脂类挥发性代谢物的影响，利用固相微萃取-气相色谱-质谱(SPME-GC-MS)联用分析系统,对包括威氏海链藻(Conticribraweissflogii)、新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)、角毛藻(Chaetoceroscalcitrans)、扁藻(Platymonashelgolandica)、微绿球藻(Nannochloropsissp.)和叉鞭金藻(Dicrateriainornata)在内的6种不同微藻的挥发性组成进行详细测定，并通过主成分分析(PCA)发现，不同的微藻在不同生长阶段的挥发性组分不一 ，不同培养阶段的脂质挥发性代谢物明显改变，这些挥发性脂类代谢物在一定程度上可能会影响贝类的摄食选择[20]。

以上饵料微藻脂质组成研究为滩涂贝类饵料种类选择、培养条件选择及投喂阶段选择提供了营养学基础和依据。

2 针对不同发育阶段贝类的微藻饵料选择

通过对不同贝类投喂不同种类的微藻发现，不同种类的微藻对不同贝类的饵料效果有着较大的差别[21]；同时研究发现，微藻种类会影响贝类的脂类组成，贝类摄取不同的微藻后脂类组成存在明显差异[22]。所以通过对贝类稚贝混合投喂不同饵料微藻组合后，检测稚贝中的脂类物质并进行PCA分析，结果表明混合投喂后的稚贝脂类组成，跟单独投喂饵料效果优异的微藻饵料的稚贝脂类组成在第一主成分方向上很接近，而与单独投喂其他饵料效果较差的微藻饵料的稚贝脂类组成相差较大，说明在混合投喂过程中，稚贝会选择性优先摄食和同化饵料效果良好的微藻[23]。

在以上理论基础上通过实际的饵料效果实验，总结了不同种类滩涂贝类在不同培养阶段的饵料选择：在浮游阶段，所有贝类初始最适微藻均为金藻，从第2、3天开始，可以辅以投巴夫藻(Diacronemaviridis)，泥蚶和毛蚶从第4天开始，缢蛏、青蛤、毛蚶、彩虹明樱蛤、菲律宾蛤仔、硬壳蛤从第3天开始可以投喂角毛藻、假微型海链藻。在浮游阶段最好都以金藻为主，浮游中期投巴夫藻，到每种苗的浮游后期则均投以假微型海链藻和角毛藻为主。在稚贝前期阶段，对泥蚶和毛蚶而言，最佳微藻饵料组合为角毛藻、假微型海链藻和金藻，辅以扁藻；对缢蛏则为假微型海链藻和角毛藻，辅以金藻；对青蛤、菲律宾蛤仔、硬壳蛤为假微型海链藻、角毛藻和扁藻，辅以金藻；在稚贝后期阶段，当稚贝大于0.5 mm时，可以加投威氏海链藻。

除此之外，在滩涂贝类实际育苗过程中，需要注意几个“选择”：由于不同种类的微藻有着不同的最佳合适培养条件，需要根据在不同季节培养的贝类品种，选择在该季节温度下适宜培养且饵料效果优异的饵料微藻进行培养；也需要根据育苗场所水质盐度条件，选择该盐度条件下最适宜培养且饵料效果优异的饵料微藻进行培养；又由于微藻不同培养阶段营养效果不一样，就需要选择微藻培养过程中营养效果最佳的阶段进行投喂。

3 基于饵料微藻营养学筛选出优质饵料微藻新种株

从东海露天围塘和自然水域中分离纯化出17种微藻纯藻株(表1)，分别是隶属于中心硅藻纲Coscinodiscophyceae的脆根管藻(Rhizosoleniafragilissima)、布氏双尾藻(Ditylumbrightwellii)、中华盒形藻(Bidduphiasinensis)、佛氏海毛藻(Thalassiothrixfrauenfeldii)、威氏海链藻(Conticribraweissflogii)及假微型海链藻(Thalassiosirapseudonana)；隶属于针胞藻纲Raphidphyceae的赤潮异弯藻(Heterosigmaakashiwo)；隶属于纵裂甲藻纲Desmophyceae的海洋原甲藻(Prorocentrummicans)和尖叶原甲藻(Prorocentrumtriestinum)；隶属于甲藻纲Dinophyceae的锥状斯克里普藻(Scrippsiellatrochoidea)、共生甲藻(SymbodiniumSymbodiniumsp.)、沃氏藻(Woloszynskiasp.)、米氏凯伦藻(KareniamikimotoiHasen)及裸甲藻(Gymnodiniumsp.)；隶属于颗石藻纲Coccolithophyceae的颗石藻(Pleurochrysissp.)；隶属于大眼藻纲Eustigmatophyceae一株微拟球藻(从福建云霄县分离出，又称“云微藻”(Nannochloropsissp.)和假微型海链藻9006(Thalassiosirapseudonana)。

表1 从东海海域分离出的17种微藻新种株总脂含量

表2 17种微藻的脂肪酸组成

对这17株新分离出的微藻种株进行脂肪酸组成分析(表2)，可以发现，在所有微藻中，威氏海链藻9021、假微型海链藻9005和假微型海链藻9006的DHA和EPA的含量均相对较高，而由于微拟球藻(云微藻)不仅含有很高的EPA(29.2%)，同时也含有最高的AA组成(5.7%)，所以选择这4株微藻进行进一步饵料效果研究。

缢蛏目前已经成为我国最重要的经济贝类品种，故选择缢蛏作为研究对象，研究以上新筛选出的4株筛选微藻和4株常用微藻角毛藻(Chaetoceroscalcitrans)、 金藻(Isochrysisgalbana)、扁藻(Platymonassubcordiformis)和微拟球藻(Nannochloropsisoculata)，对两种规格的缢蛏稚贝(壳长分别为 0.37 mm和 1.07 mm)生长率和成活率的影响[24]。结果表明，单种投喂小规格稚贝时,投喂角毛藻和金藻的稚贝生长率和成活率最高而投喂扁藻、微拟球藻和威氏海链藻的最低；单种投喂大规格稚贝时，威氏海链藻体现了最佳的饵料营养价值而微拟球藻的营养价值最低。混合投喂大规格稚贝时，8种微藻全混合的饵料显示了最好的饵料营养价值，而且绝大多数两两混合的微藻饵料效果比对应的单种微藻要好。另外，单种投喂威氏海链藻的大规格稚贝的生长率和成活率仅次于8种微藻全混合的却要高于其他大多数投喂两两混合微藻的稚贝，可见大规格缢蛏稚贝与威氏海链藻表现出高度的营养匹配。

一株微藻能否应用到实际生产中，除了其营养组成要符合贝类需求外，还需要在露天环境条件下容易扩大繁殖，故对前期筛选所得的几种微藻进行培养环境因子研究。影响微藻繁殖的因素主要包括温度、盐度、光照和培养液的组成。实际生产中不同的温度对应着不同的季节培养，不同光照对应着不同的天气条件，盐度不同则对应不同盐度水源。从实验室条件开始进行饵料微藻的培养研究，主要选择温度、盐度、光照、营养盐组成等因子进行单因子或多因子调控实验，确定了不同微藻最适繁殖的环境条件，分析了4种饵料微藻对应的适宜环境条件(表3)。

表3 4种饵料微藻对应的适宜环境条件

表3显示，假微型海链藻9005和假微型海链藻9006在弱光下繁殖速度最快，是迄今为止发现的弱光照条件下繁殖速度最快的品种，说明在一般的阴雨季节该藻也能正常繁殖，可以保证贝类苗种繁育季节在阴雨天也能获得充足的饵料，而目前贝类苗种行业使用的角毛藻、扁藻和金藻等的最适宜光照强度均在4000 Lx以上，一旦碰到持续的阴雨天，会使得育苗生产中的饵料供给遭受严峻的考验。假微型海链藻的应用，从根本上消除该制约因素，从而确保贝类苗种生产的稳定性。

另外，以前常用耐高温藻只有角毛藻，而从表3也可以看出，筛选出威氏海链藻9021，可以耐受超过30℃高温，并且威氏海链藻9021藻个体较大，接种后适应期较短，充气条件下非常不容易衰败，繁殖速度非常快，一般晴天时只需要1 d，藻细胞就可以从10万/mL 迅速繁殖到超过60万/mL，如果投喂后留存1/5后再加水满后，晴天条件下1 d就可很快繁殖到超过60万/mL，同时假微型海链藻9006也可以耐受超过28 ℃的高温，这就给夏季进行贝类苗种培育提供了更多的饵料选择。另外，威氏海链藻的高营养价值及极快的繁殖效率，给大规格贝类苗种培育过程中微藻饵料高通量连续供给提供了根本保障。

目前，威氏海链藻9021、假微型海链藻9005和假微型海链藻9006已经于2015年由宁波大学免费向全国贝类苗种行业提供，2016年已经成为全国所有滩涂贝类苗种培育企业的当家饵料品种，并也已经应用到虾蟹苗种培育中，显示出极佳的应用前景。

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Screening and application of advanced microalgae diet for shellfish culture based on the lipid composition

CHEN Wen-bi， XU Ji-lin， ZHOU Chen-xu， YAN Xiao-jun

(School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Microalgal diet is the key factor in shellfish growth and breeding. To gain a thorough knowledge of the effect of microalgal diets on the growth of early life stages of bivalves, liquid chromatograph - mass spectrometer (LC-MS) analytical method about high-sensitivity and high-definition of structure information for microalgae and shellfish was established, and a breeding mode with selective feeding of different microalgae bait according to different shellfish at different development stages was also built. Many unicellular microalgae were isolated and purified from natural water. Eventually, two microalgal species (3 strains) with high efficient bait effects on shellfish juvenile at different stages were screened out based on the lipid composition and the actual effect of lipid nutrients bait, which filled the gap of feed supply for shellfish breeding in rainy season. Meanwhile, high-throughput and continuous supply of microalgal diets for larger juveniles had been realized.

shellfish; microalgal diets; lipid nutritional factor; screening; application

2016-07-11；

2017-02-20

国家自然科学基金(31172448); 教育部博士点基金优先发展领域项目(20133305130001)；浙江自然科学基金项目(LY15C190004); 宁波市科技攻关项目(2014C10005)

陈文笔，硕士研究生，从事海洋生物化学研究，E-mail: 824683107@qq.com

徐继林，研究员，博士生导师，研究方向为藻类生化代谢、藻类与饵料生物资源及其利用等， E-mail: xujilin@nbu.edu.cn

Q949.2

A

2095-1736(2017)02-0016-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.02.016