二甲双胍增强LPS激活的腹腔巨噬细胞在ATP刺激下的炎症小体活化

魏红霞，李陈广，梁译丹，徐丽慧，潘 浩，何贤辉，欧阳东云

(暨南大学生命科学技术学院1.免疫生物学系，2.细胞生物学系，广东 广州 510632)

二甲双胍增强LPS激活的腹腔巨噬细胞在ATP刺激下的炎症小体活化

魏红霞1，李陈广1，梁译丹1，徐丽慧2，潘 浩1，何贤辉1，欧阳东云1

(暨南大学生命科学技术学院1.免疫生物学系，2.细胞生物学系，广东 广州 510632)

目的 以脂多糖(LPS)激活的腹腔巨噬细胞为炎症细胞模型，探讨糖尿病常用药物二甲双胍对胞外ATP诱导炎症小体活化并释放白细胞介素-1β(IL-1β)的影响。方法 C57BL/6小鼠腹腔注射30 g·L-1巯基乙酸盐(thioglycollate, TG)诱导腹腔巨噬细胞大量产生；利用LPS+ATP处理激活炎症小体，采用碘化丙锭(PI)染色法检测二甲双胍对LPS+ATP诱导的腹腔巨噬细胞焦亡的影响，免疫印迹法检测该细胞胞内及上清中IL-1β和caspase-1的表达水平；免疫荧光技术检测巨噬细胞P2X7嘌呤能ATP受体7(P2X7R)的亚细胞分布及荧光强度。结果 单独二甲双胍不会导致LPS激活细胞发生焦亡，但二甲双胍呈剂量依赖性促进LPS+ATP诱导的细胞焦亡 ；免疫印迹法显示，在蛋白水平上，单独LPS(或LPS+二甲双胍)刺激不能诱导细胞释放成熟IL-1β(17 ku)到细胞外；当加入ATP刺激后，成熟IL-1β和活化caspase-1(10 ku)释放到胞外；而二甲双胍可以剂量依赖性地促进LPS激活、ATP刺激下腹腔巨噬细胞释放成熟IL-1β和活化caspase-1的水平。结论 二甲双胍增强LPS激活的腹腔巨噬细胞在ATP刺激下的炎症小体活化，提高caspase-1活化和成熟IL-1β释放，促进炎症反应。

二甲双胍；细胞焦亡；腹腔巨噬细胞；白细胞介素-1β；半胱氨酸天冬氨酸酶-1；炎症小体

病原微生物感染，首先启动的是简并识别的固有免疫系统，其中吞噬细胞起着关键作用。吞噬细胞表面或细胞内部的模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)，识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，如革兰阴性菌的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，启动炎症反应，包括激活NF-κB信号通路，上调肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β前体(pro-interleukin-1β, pro-IL-1β, 31 ku)等炎症细胞因子的表达；并能进一步激活炎症小体和caspase-1[1]，使pro-IL-1β剪切成为成熟的IL-1β(17 ku)。激活炎症小体是机体最重要的固有免疫防御机制之一，包括：激活半胱氨酸天冬氨酸酶-1/-11(caspase-1/-11)，剪切pro-IL-1β、gasdermin D等，促进IL-1β等炎症因子成熟和释放[2]。然而，最近有研究表明，成熟IL-1β只有在细胞死亡时才会被释放到细胞外[3]。与成熟IL-1β释放相关的细胞死亡可以通过PAMP(如：核酸、脂蛋白和LPS)首先激活巨噬细胞，然后以ATP或其他内源性损伤相关分子模式(danger-associated molecular patterns, DAMPs)(如尿酸钠晶体)刺激来诱导其发生；这种细胞死亡方式伴随着炎症小体和caspase-1的活化(产生caspase-1 p10活性片段)，称之为细胞焦亡。细胞焦亡的特征表现为细胞膜孔的快速形成(碘化丙锭等细胞核染料可籍此进入细胞)，从而导致细胞内炎症物质的释放和细胞破裂，而有研究表明caspase-1的活化可以增加细胞内钙离子水平和细胞膜的通透性，从而有利于成熟IL-1β、HMGB1以及其他内容物通过溶酶体胞吐作用释放到胞外[4]。

二甲双胍(metformin)是一种用于治疗2型糖尿病的一线药物，许多研究也表明二甲双胍不仅能通过改善代谢参数，如高血糖、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、血脂异常等来改善慢性炎症，同时具有直接的抗炎作用[5]。为了探索二甲双胍药物对急性炎症条件下发生的细胞焦亡和IL-1β释放的影响，本研究利用LPS作为PAMP活化腹腔巨噬细胞，以ATP作为DAMP激活炎症小体并诱导细胞焦亡的发生，探讨了二甲双胍对巨噬细胞的细胞焦亡、caspase-1活化和成熟IL-1β释放的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 C57BL/6小鼠，♀，6～8 周龄，体质量(20.0±2.0)g，购于南方医科大学实验动物中心。细菌脂多糖(LPS)、三磷酸腺苷(ATP)、碘化丙锭(propidium iodide, PI)、Hoechst 33342、Tween-80、兔抗P2X7嘌呤能受体7抗体等购于Sigma-Aldrich公司。巯基乙酸盐(thioglycolate, TG)购自Becton Dickinson 公司。DMEM、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺为Gibco/Invitrogen公司的产品。二甲双胍(metformin)购买于Beyotime公司。抗β-tubulin、IL-1β、caspase-1等抗体以及辣根过氧化物酶标记二抗购买于Cell Signaling Technology公司。AlexaFluor488-CD11b购自eBioscience公司。

1.2 实验仪器 SDS-PAGE电泳系统(美国 Bio-Rad公司 MINI Protean2)；Zeiss荧光倒置显微镜(德国Zeiss公司，Axio Observer D1)；Alpha化学发光凝胶成像系统(美国Alpha Innotech，FluorChem 8000)。

1.3 细胞培养 C57BL/6小鼠腹腔注射500 μL 30 g·L-1TG溶液，4 d后，断颈处死，用含50 mL·L-1FBS和0.5 mmol·L-1EDTA的PBS洗出小鼠腹腔液，300×g离心10 min，重悬于完全培养基中(含青霉素100 000 U·L-1、链霉素100 mg·L-1、L-谷氨酰胺25 mmol·L-1、100 mL·L-1FBS)。在37℃，5% CO2培养箱中培养2 h后，洗去非贴壁细胞，换成新鲜的完全培养基，剩下的贴壁细胞即为腹腔巨噬细胞，将其在培养箱中培养过夜。

1.4 细胞焦亡检测 参考前文[6]方法，简述如下：将30 g·L-1TG诱导产生的腹腔巨噬细胞接种在24孔板中。过夜后，加入二甲双胍处理1 h，其浓度从低到高依次为0.22、0.67、2 mmol·L-1，接着用0.5 mg·L-1的LPS诱导4 h，然后加入2 mmol·L-1ATP刺激30 min，最后PI和Hoechst 33342双染色10 min，置于蔡司倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.5 免疫印迹法 将30 g·L-1TG诱导产生的腹腔巨噬细胞接种在6孔板中，分成9组；先用0.5 mg·L-1的LPS诱导4 h，然后二甲双胍(0.22、0.67、2 mmol·L-1)处理1 h，最后加入2 mmol·L-1ATP刺激30 min；分别提取细胞和上清(各样品等体积)中的总蛋白，对细胞裂解液中的蛋白进行定量；分别进行SDS-PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，用封闭液(含50 g·L-1脱脂奶粉和1 mL·L-1Tween-20的PBS溶液)封闭1 h，一抗在4℃摇床孵育过夜，然后辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育1 h，碧云天公司的BeyoECL Plus化学发光试剂盒显色，X光片显影。最后用FluorChem 8000成像仪记录结果，用AlphaEaseFC软件进行条带灰度分析。

1.6 免疫荧光分析 参考前文[7]方法，简述如下：将30 g·L-1TG诱导产生的腹腔巨噬细胞接种在玻底培养皿中，LPS和二甲双胍的处理方法同上。最后吸弃其培养基，每孔加1 mL 40 g·L-1多聚甲醛，室温固定15 min，然后每孔加2 mL冷甲醇于-20℃条件下通透 10 min，再用封闭液室温封闭1 h，加一抗(100 μL每孔，其中P2X7R为1 ∶100，AlexaFluor488-CD11b为1 ∶50)，4℃孵育过夜，洗涤后加无交叉反应的CF568-山羊抗兔IgG(美国Biotium公司)，室温孵育1 h，Hoechst 33342染核10 min并避光，蔡司荧光显微镜观察，拍照。

2 结果

2.1 二甲双胍促进ATP诱导的腹腔巨噬细胞的细胞焦亡 在本实验中，采用文献常用的LPS+ATP处理诱导细胞焦亡，PI染色用于指示焦亡的细胞[8]。结果表明，LPS和二甲双胍本身不能诱导腹腔巨噬细胞发生焦亡(Fig 1A)。ATP可刺激LPS激活的腹腔巨噬细胞发生焦亡，且二甲双胍处理，可明显促进LPS+ATP诱导的细胞焦亡并具有量效关系(Fig 1B, 1C)。从细胞形态上，加入ATP之后，细胞膜明显变圆肿胀，甚至破裂成细胞碎片。PI染料可穿过细胞膜进入核内，发出红色荧光。上述结果表明，二甲双胍可剂量依赖性地促进ATP诱导的巨噬细胞焦亡。

Fig 1 Metformin promotes cell pyroptosis of TG-elicited peritoneal macrophages induced by LPS+ATP(n=4)

A & B: Fluorescence images of TG-elicited peritoneal macrophages stained with propidium iodide(PI)(red) and Hoechst 33342(blue) dyes. The insets showed one of the PI-positive(pyroptotic) cells.C:Statistical analysis of the ratios of pyroptotic cells(PI-positive) in each group;**P<0.01vsLPS+ATP group

2.2 二甲双胍促进ATP刺激下腹腔巨噬细胞炎症因子IL-1β的释放 文献提示，细胞焦亡伴随着炎症小体和caspase-1的活化以及成熟的IL-1β(17 ku)的释放[3]。由于ATP诱导细胞焦亡，因此本研究通过免疫印迹法从蛋白表达水平上分析二甲双胍对LPS+ATP处理的腹腔巨噬细胞表达IL-1β及其他炎症小体活化标志性蛋白caspase-1活化的影响。结果显示，单独LPS刺激可促进腹腔巨噬细胞pro-IL-1β(31 ku)的表达，但不影响腹腔巨噬细胞内pro-caspase-1(45 ku)的表达水平(Fig 2A, cell lysates)，而且细胞培养上清中未检测到活化的caspase-1p10(10 ku)和成熟的IL-1β(17 ku)释放(Fig 2A, supernatant，所有样品来自等体积的细胞培养上清)。当细胞加入第二信号ATP刺激后，细胞培养上清中可明显检出被细胞释放的活化的caspase-1p10(10 ku)和成熟的IL-1β(17 ku)(Fig 2A, 2B, 2C, supernatant)。二甲双胍处理可进一步促进上述ATP诱导的巨噬细胞释放活化的caspase-1p10(10 ku)和成熟的IL-1β(17 ku)蛋白，并具有明显的量效关系；但如果没有ATP的刺激，二甲双胍本身(或与LPS联合)不能促进活化的caspase-1和成熟的IL-1β的释放水平(Fig 2A, 2B, 2C, supernatant)。因此，上清中活化的caspase-1p10和成熟的IL-1β的释放水平，可能与细胞焦亡率密切相关。这一点与上述细胞焦亡检测结果以及前人发表的文献相符[3]。值得一提的是，细胞裂解液中只检测到pro-caspase-3(35 ku)的表达，而没有检测到活化的caspase-3(17、19 ku)的表达水平(Fig 2A, cell lysates)，说明细胞凋亡(一种依赖caspase-3的细胞死亡方式)可能未参与上述活化的caspase-1p10和成熟的IL-1β的释放过程。

2.3 二甲双胍上调P2X7R受体在细胞膜上的表达 上述结果中发现二甲双胍可促进LPS+ATP诱导的腹腔巨噬细胞发生焦亡，并伴随成熟IL-1β和活化caspase-1p10的释放。有趣的是，机体受细菌感染后可释放ATP，胞外ATP经细胞膜上的受体介导，尤其是P2X7R，导致K+的释放和炎症小体的活化[9]，提示二甲双胍促进炎症反应和细胞焦亡可能与上调ATP受体P2X7R的表达有关。结果如Fig 3(A, B)所示，经2 mmol·L-1二甲双胍处理的LPS激活的腹腔巨噬细胞的细胞膜上P2X7R的荧光强度明显大于对照组和单独LPS处理组的荧光强度。这表明，二甲双胍可能是通过上调P2X7R在细胞膜上的表达来促进细胞焦亡以及成熟IL-1β和活化caspase-1p10的释放。

3 讨论

LPS是革兰阴性菌表达的PAMP，可被Toll样受体4(TLR4)或细胞内的caspase-11识别[10]。LPS与TLR4结合后，可以激活炎症信号通路，上调pro-IL-1β和炎症小体组分NLRP3等蛋白的表达；当以ATP为第二信号刺激后，引起NLRP3炎症小体的组装，激活caspase-1的活化(形成具有蛋白酶活性的caspase-1p10片段并释放到胞外)，促进IL-1β的成熟，并在细胞膜上形成孔洞，使成熟的IL-1β等炎症因子得以释放[3]。因此，活化的caspase-1p10和成熟的IL-1β的释放，可作为巨噬细胞炎症小体激活的标志。多项研究表明，caspase-1/-11的表达及其介导的炎症因子释放和细胞焦亡，有利于抑制感染(包括葡聚糖硫酸钠DSS诱导的小鼠急性肠炎)，加快组织修复[11-12]。细胞焦亡有利于胞内致病菌的释放，并被其他吞噬细胞所吞噬、杀伤而清除，防止致病菌在胞内的繁殖和持续存在[13]。因此，增强感染部位的炎症小体的活化和感染细胞(或被激活细胞)的焦亡，可能有利于加强局部炎症反应，加速清除致热源(病原微生物及其PAMP所激活的固有免疫细胞)、促进损伤组织的修复和疾病的痊愈。另一方面，细胞焦亡是活化巨噬细胞的重要退出机制之一；如果巨噬细胞持续激活而不发生焦亡，其免疫代谢通路已经发生改变，导致脂类沉积，成为泡沫细胞或脂肪巨噬细胞，这些细胞持续不断地分泌炎症因子和趋化因子，募集其他免疫细胞至病灶组织，将增加动脉粥样硬化和肥胖症等慢性炎症性疾病的风险[14]。本研究发现，二甲双胍可以促进LPS激活的腹腔巨噬细胞在ATP刺激下导致的细胞焦亡以及成熟IL-1β的释放。有趣的是，介导IL-1β成熟的蛋白酶caspase-1p10(活性形式)的释放量亦随之增加。也就是说，二甲双胍可增强ATP诱导的腹腔巨噬细胞的炎症小体的活化及其信号通路。该结果提示，二甲双胍可用于增强感染部位的炎症反应，促进被感染细胞(或被激活细胞)发生焦亡，从而清除病灶中的活化细胞，防止其因细胞长期存活而持续释放炎症细胞因子，降低慢性炎症性疾病(如动脉粥样硬化和肥胖)的风险。

Fig 2 Metformin promotes release of IL-1β and caspase-1 p10 from TG-elicited peritoneal macrophages induced by LPS+ATP stimulation(n=3)

A:Western blot bands of proteins from the supernatants and cell lysates, respectively; Total proteins in the supernatant of each group came from an equal volume of supernatant of equal cell numbers. B & C: The relative gray levels of the Western blot bands of caspase-1 p10(B) and mature IL-1β(C) from respective cell culture supernatants, setting the gray-scale value of(LPS+ATP) bands as 1, respectively.*P<0.05,**P<0.01vsLPS+ATP group

Fig 3 Metformin increases membranous immunofluorescence intensity indicating redistribution of P2X7R (n=100)

A:Immunofluorescence images of P2X7R(red) and CD11b(green, cell membrane marker of peritoneal macrophages);the nuclei were revealed by Hoechst 33342 staining(blue) and the merged images of P2X7R, CD11b and nuclei were also shown. B:Statistical analysis of the mean fluorescence intensities of P2X7R on cell membranes.**P<0.01vscontrol

然而，全身性感染(败血症)可引起多器官功能衰竭，因感染而诱发的细胞焦亡可能是器官功能衰竭的原因之一[15-16]。由于多器官功能衰竭进程非常迅速，机制尚不明确，目前尚无特异性的治疗办法。在这种情况下，防止细胞焦亡可能是防止败血症病人多器官功能衰竭的关键。二甲双胍可以促进ATP诱导的巨噬细胞发生焦亡，提示在机体受到严重感染(包括败血症)的情况下，2型糖尿病患者不宜服用二甲双胍。

本研究发现，二甲双胍促进ATP诱导的腹腔巨噬细胞发生焦亡，可能与其上调ATP受体在细胞膜上的分布有关。由于细胞焦亡的发生非常迅速(30 min以内)，ATP受体如何通过快速重分布而增强ATP诱导细胞焦亡的作用，需要更多的实验数据才能明确。另外，二甲双胍有多种生物学效应，包括上调AMPK的活性，其促进细胞焦亡效应是否与此有关，也需要更多的实验证据支持。深入研究上述问题，可扩展二甲双胍的临床用途，如用于增强局部炎症小体的激活，促进细胞焦亡，从而快速清除感染病灶，去腐生肌，防止发展为迁延性的慢性炎症性疾病；也有利于更好地指导糖尿病患者合理服用二甲双胍。

(致谢：本论文实验在暨南大学生命科学技术学院免疫生物学系完成。魏红霞、李陈广负责动物饲养、细胞培养和药物处理等工作；徐丽慧、梁译丹参与了动物腹腔巨噬细胞的诱导和培养实验；徐丽慧、潘浩参与了免疫荧光实验；欧阳东云教授、何贤辉教授参与了实验设计、实验指导等工作。)

[1] 王 伟, 戴 敏, 徐忠东. 丹皮酚对脂多糖/三磷酸腺苷诱导的小胶质细胞NLRP3炎症小体激活的影响[J]. 中国药理学通报, 2014, 30(5): 652-6.

[1] Wang W, Dai M, Xu Z D. Effects of paeonol on lipopolysaccharide/adenosine 5’-triphosphate induced NLRP3 inflammasome activation in primary rat microglia[J].ChinPharmacolBull,2014,30(5): 652-6.

[2] Kayagaki N, Stowe I B, Lee B L, et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling[J].Nature, 2015, 526(7575): 666-71.

[3] Cullen S P, Kearney C J, Clancy D M, et al. Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1β secretion by triggering necrosis[J].CellRep, 2015, 11(10): 1535-48.

[4] Davis M J, Swanson J A. Technical advance: caspase-1 activation and IL-1β release correlate with the degree of lysosome damage, as illustrated by a novel imaging method to quantify phagolysosome damage[J].JLeukocBiol, 2010, 88(4): 813-22.

[5] 李业琼, 叶山东, 翟丽敏,胡 闻. 二甲双胍对2型糖尿病模型大鼠肾组织AGEs表达的影响[J]. 中国药理学通报,2016, 32(5): 703-7.

[5] Li Y Q, Ye S D, Zhai L M, Hu W. Effects of metformin on expression of renal tissue AGEs in type 2 diabetic rats[J].ChinPharmacolBull,2016,32(5):703-7.

[6] Lin Q R, Li C G, Zha Q B, et al. Gossypol induces pyroptosis in mouse macrophages via a non-canonical inflammasome pathway[J].ToxicolApplPharmacol, 2016, 292: 56-64.

[7] Huang M Y, Pan H, Liang Y D, et al. Chemotherapeutic agent CPT-11 eliminates peritoneal resident macrophages by inducing apoptosis[J].Apoptosis, 2016, 21(2): 130-42.

[8] Py B F, Jin M, Desai B N, et al. Caspase-11 controls interleukin-1β release through degradation of TRPC1[J].CellRep, 2014, 6(6): 1122-8.

[9] Idzko M, Ferrari D, Eltzschig H K. Nucleotide signalling during inflammation[J].Nature, 2014, 509(7500): 310-7.

[10]Shi J, Zhao Y, Wang K, et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death[J].Nature, 2015, 526(7575): 660-5.

[11]Demon D, Kuchmiy A, Fossoul A, et al. Caspase-11 is expressed in the colonic mucosa and protects against dextran sodium sulfate-induced colitis[J].MucosalImmunol, 2014, 7(6): 1480-91.

[12]Oficjalska K, Raverdeau M, Aviello G, et al. Protective role for caspase-11 during acute experimental murine colitis[J].JImmunol, 2015, 194(3): 1252-60.

[13]Jorgensen I, Miao E A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens[J].ImmunolRev, 2015, 265(1): 130-42.

[14]Li X, Zhang Y, Xia M, et al. Activation of Nlrp3 inflammasomes enhances macrophage lipid-deposition and migration: implication of a novel role of inflammasome in atherogenesis[J].PLoSOne, 2014, 9(1): e87552.

[15]Bauer C, Duewell P, Mayer C, et al. Colitis induced in mice with dextran sulfate sodium(DSS) is mediated by the NLRP3 inflammasome[J].Gut, 2010, 59(9): 1192-9.

[16]Wree A, Eguchi A, McGeough M D, et al. NLRP3 inflammasome activation results in hepatocyte pyroptosis, liver inflammation, and fibrosis in mice[J].Hepatology, 2014, 59(3): 898-910.

Metformin enhances ATP-stimulated inflammasome activation in LPS-primed peritoneal macrophages

WEI Hong-xia1,LI Chen-guang1,LIANG Yi-dan1,XU Li-hui2, PAN Hao1, HE Xian-hui1, OUYANG Dong-yun1

(1.DeptofImmunobiology; 2.DeptofCellBiology,CollegeofLifeScienceandTechnology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)

Aim To explore the influence of metformin(a first-line drug for type 2 diabetes) on ATP-induced inflammasome activation and the release of interleukin-1β(IL-1β) by LPS-activated peritoneal macrophages, a commonly-used inflammatory cell model.Methods Peritoneal macrophages were elicited by intraperitoneal injection of 30 g·L-1thioglycollate into C57BL/6 mice. Inflammasome was activated and cell pyroptosis was induced by LPS plus ATP treatment, and the pyroptotic cells were calculated after propidium iodide(PI) staining. The protein levels of IL-1β and caspase-1 expressed in the cells and released from them into the supernatant were evaluated by Western blot. Immunofluorescent microscopy was recruited to detect the subcellular distribution and fluorescent intensity of the purinergic P2X7receptor(P2X7R).Results Metformin per se did not induce pyroptosis in LPS-activated peritoneal macrophages, but it significantly and dose-dependently increased cell pyroptosis induced by ATP treatment. At protein levels, maturated IL-1β(17 ku) could not be released from the cells upon single LPS or LPS plus metformin stimulation;but after ATP was added, maturated IL-1β was released into the supernatants of the cells. Moreover, metformin dose-dependently increased the protein levels of both maturated IL-1β and active caspase-1 released by the LPS-activated peritoneal macrophages upon ATP stimulation.Conclusion Metformin intensifies the activation of inflammasome and increases the release of active caspase-1 and maturated IL-1β upon ATP stimulation in the LPS-activated peritoneal macrophages, which should promote inflammatory responses.

metformin; pyroptosis; peritoneal macrophages; interleukin-1β (IL-1β); caspase-1; inflammasome

时间：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1247.014.html

2016-12-19,

2017-01-20

国家自然科学基金资助项目(No 81173604，81373423)

魏红霞(1991-)，女，硕士生，研究方向：炎症与抗炎免疫药理学，E-mail: 289948128@qq.com; 欧阳东云(1967-)，男，博士，研究员，研究方向: 炎症与抗炎免疫药理学，通讯作者， E-mail: dongyun1967@aliyun.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.007

A

1001-1978(2017)04-0474-06

R-332；R329.24；R364.5；R392.11；R392.12；R977.15