无溶剂体系酶促合成肉豆蔻酸淀粉酯及其性质研究

包雪梅 牛黎莉 汪 月 陈 瑾 禹 洁 方琳凯 张 珍 张盛贵

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，兰州 730070）

无溶剂体系酶促合成肉豆蔻酸淀粉酯及其性质研究

包雪梅 牛黎莉 汪 月 陈 瑾 禹 洁 方琳凯 张 珍 张盛贵

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，兰州 730070）

在无溶剂体系中，采用Novozyme 435作为催化剂，肉豆蔻酸和马铃薯淀粉作为原料，制备不同取代度的肉豆蔻酸淀粉酯。研究反应温度、脂肪酶添加量、底物比（淀粉∶肉豆蔻酸）及反应时间对淀粉酯取代度的影响，并对原淀粉及不同取代度的酯化淀粉的物化性质进行了研究。结果表明，反应温度60℃，脂肪酶添加量2%，底物比1∶4，反应时间25 h时，制得的肉豆蔻酸淀粉酯的取代度为0.056。肉豆蔻酸淀粉酯具有较好的疏水性及乳状液稳定性，凝胶强度较原淀粉有所下降。

酶促合成 马铃薯淀粉 肉豆蔻酸淀粉酯

肉豆蔻酸即十四烷酸，属于中长链脂肪酸，在淀粉中引入类似的疏水性有机碳链，可改善原淀粉的冷水不溶性、糊热稳定性差、抗剪切性能低等缺点，制得具有特殊的热塑性、疏水性、乳化性和可生物降解性的脂肪酸淀粉酯［1-2］，并使淀粉具备了亲水亲油的双亲性质［3-4］。目前，国内外报道的制备酯化淀粉的方法有水媒法、溶剂法、熔融法等，而以脂肪酶为催化剂的合成方法则为少见［5］；酶法制备的脂肪酸淀粉酯具有天然绿色、低碳环保等优点［6］，更适合应用于食品和医药行业［6］。Novozyme 435是一种固定化脂肪酶，其底物作用范围宽且性质稳定，可广泛应用于水解、酯化、转酯化反应。Lin等［1］报道以Novozyme 435作为催化剂，酶促合成的松香酸淀粉酯，其热稳定性、溶解度、膨胀度及透明度相对于原淀粉均有所改善。与传统的水相和有机相酶催化相比，无溶剂体系酶催化的研究较大地扩展了酶的应用范围。无溶剂体系中，酶直接作用于底物，提高了底物、产物浓度以及反应选择性［7］，纯化过程容易、步骤少，因不用或少用有机溶剂而大大降低了对环境的污染，降低了回收有机溶剂的成本［8］。王艳等［9］报道了在无溶剂体系中，以玉米淀粉和油酸为原料，制得取代度为0.201的油酸淀粉酯。但使用无溶剂体系，酯化反应速率较低，有助于生产满足食品需要的低取代度淀粉酯。

国内外关于酯化淀粉的研究已经有很多文献报道［10-11］，但是对酶促合成肉豆蔻酸酯化淀粉的研究鲜见报道。本试验采用无溶剂体系酶促合成法，以预处理淀粉为原料，肉豆蔻酸为酯化剂，Novozyme 435作催化剂，研究了不同反应条件对豆蔻酸淀粉酯取代度的影响，并对不同取代度酯化淀粉进行FTIR、疏水性、质构特性及微观结构等性质进行测定。以期为酶促合成中长链脂肪酸淀粉酯制备方面的应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马铃薯淀粉：甘肃薯界淀粉有限公司；Novozym 435（活力：10 000 PLU／g）：诺维信（中国）投资有限公司；肉豆蔻酸：天津市光复精细化工研究所；其他试剂或药品均为分析纯；3A型分子筛：上海山浦化工有限公司；溴化钾：德州润昕实验仪器有限公司。

FTIR-650型傅里叶变换红外光谱仪：中国天津港东科技发展股份有限公司；UV-2450型紫外分光光度计：日本岛津有限公司；TA.XT型质构仪：Texture Analyser Stable Micro Systems公司；FS-400D高速分散器：北京同德创业科技有限公司；CX21FS1C型生物显微镜：奥林巴斯（广州）工业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 肉豆蔻酸淀粉酯的合成方法

称取一定质量的肉豆蔻酸、Novozym 435、马铃薯淀粉分别置于装有3A分子筛的3个标记好的密闭容器中静置48 h，以平衡体系水分。肉豆蔻酸置于150 mL碘量瓶中，60℃水浴融化后，加入一定质量比的马铃薯原淀粉和Novozym 435，在一定温度条件下以180 r／min的转速磁力搅拌，反应期间加入一定量的3A分子筛，一定时间后加入10 mL 60℃95%乙醇浸泡10 min以沉淀肉豆蔻酸淀粉酯，然后抽滤，后用60℃热无水乙醇洗涤数次，恒温干燥至恒重，粉碎及过筛（80目）、密封贮藏。

1.2.2 取代度的测定

参考王艳［4］的测定方法，并略作改进。称取1.50 g烘干样品于250 mL碘量瓶中，加入25 mL蒸馏水，5 mL无水乙醇，25 mL 0.25 mol／L NaOH溶液，常温振荡60 min。取出，滴加酚酞指示剂，用0.1 mol／L

HCl溶液滴定，滴至粉红色刚好消失，记录耗用盐酸的体积数V1。同时进行空白试验，记录耗用盐酸的体积数V0。肉豆蔻酸淀粉酯取代度按式（1）计算。

式中：DS为取代度；V0为滴定空白所需要的HCl量／mL；V1为滴定样品所需要的HCl量／mL；c为标准盐酸的摩尔浓度／mol／L；m为样品的质量／g；211为肉豆蔻酸酰基的分子量；162为脱水葡萄糖单元的分子量。

1.2.3 不同反应条件对酯化反应的影响

方法1.2.1中，研究反应温度为55、60、65、70、75℃；淀粉∶肉豆蔻酸（m／m）为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6；脂肪酶用量为脂肪酶添加量为淀粉（绝干）质量的0%、0.5%、1%、2%、4%；反应时间5、10、15、20、25、30 h等不同反应条件对酯化反应的影响。反应完成后用方法1.2.2测定淀粉酯的取代度。

1.2.4 傅里叶红外光谱分析（FTIR）

参照Colussi等［12］的方法测定。

1.2.5 淀粉质构特性

参照Einhorn等［13］、Reddy等［14］的方法，并略作改进。称取6.0 g淀粉，置于150 mL烧杯中配置质量分数为6%的淀粉乳，在沸水浴中搅拌30 min，至淀粉完全糊化，后于4℃冰箱中放置24 h。用TA. XT型质构仪测定其质构特性（硬度、弹性、胶黏性、回复力、内聚性及咀嚼性）。试验参数设定：选用TPA压缩模式，探头型号P／5，测试前下降速率1.0 mm／s，测试速率1.0 mm／s，测试后上升速率1.0 mm／s，停留间隔5 s，2次压缩间隔5 s，压缩程度30%，感应力3 g，数据提取速率200 pps。每个样品重复6次。

1.2.6 疏水性测定

参考Tupa等［15］的方法测定。

1.2.7 乳状液的制备

参考朱波等［16］的制备方法，并略作改进，称取（0.5±0.05）g样品（以干基计）分散于25 mL蒸馏水中，于沸水浴中充分加热糊化15 min，冷却至室温后，于样品糊中加入25 mL大豆色拉油，用FS-400D型高速分散器以13 500 r／min的转速分散2 min，得到的乳状液加入NaN3（0.02%，m／V）作为抑菌剂。

1.2.8 微观结构

参考朱波等［16］的方法，观察乳状液的微观结构。

1.2.9 数据分析

每组试验均重复3次，采用Origin 8.0及SPSS 17.0等软件对数据进行统计分析。数据用平均值±标准差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 不同反应条件对酯化反应的影响

反应温度、底物比、反应时间及脂肪酶添加量对酯化反应的影响如图1所示。

图1 不同反应条件对酯化反应的影响

由反应温度对酯化反应的影响可知，当选取淀粉∶肉豆蔻酸（m／m）为1∶5、脂肪酶添加量为2%、反应时间为20 h，反应温度在55～75℃范围时，酯化产物的取代度呈现先增大后减小的趋势，在60℃时取代度达到最大0.042±0.001，之后显著下降（P＜0.05），在75℃时，取代度达到0.015±0.002，显著低于60℃时酯化淀粉的取代度（图1）。可见，适当的高温有助于提高淀粉溶胀能力及肉豆蔻酸的扩散速度［15］，但当温度超过60℃后，产物取代度迅速下降，主要原因是温度过高，部分脂肪酶失活（Novozyme 435脂肪酶最适温度范围为40～60℃），导致酯化效率降低，取代度降低。所以本试验选择的反应温度为60℃。

由底物比对酯化反应的影响可知，当脂肪酶添加量为2%、反应时间为20 h、反应温度为60℃时，随着淀粉：肉豆蔻酸比值的降低，产物的取代度呈现先增大后降低的趋势，当比值为1∶4时，酯化淀粉取代度达到最大0.048±0.002（图1）。Bayazeed等［17］研究发现，高乙酸酐浓度导致较高的分子碰撞率，与淀粉分子更大程度的发生反应。当底物浓度过低时，脂肪酶未完全被底物饱和，使产物取代度较低。但当底物浓度过高时，脂肪酶达到饱和，限制了酯化反应，取代度降低。选择适当的底物比，一方面可以提供所需要的酰基供体，另一方面可以降低反应体系的粘度，有利于产物的生成，因此本试验选择的最适底物比为1∶4。

由反应时间对酯化反应的影响可知，当淀粉∶肉豆蔻酸（m／m）为1∶4、脂肪酶添加量为2%、反应温度为60℃时，反应时间在5～30 h范围内，随着反应时间的增加，酯化产物的取代度呈现先增大后降低的趋势，当反应时间达到25 h时，取代度达到最大0.056±0.001（图1）。主要由于反应时间增加，各底物接触较充分，酯化反应程度增加，取代度提高。但是，反应时间过长，取代度下降，一方面由于剪切作用影响酶的稳定性，导致酶催化效率降低，另一方面，反应开始逆方向进行，副产物浓度增加，酯化产物浓度降低［4］，产物取代度显著下降。由此，25 h为最佳反应时间。

由脂肪酶添加量对酯化反应的影响可知，当淀粉∶肉豆蔻酸（m／m）为1∶4、反应时间25 h、反应温度60℃，酶添加量在0%～4%范围内时，肉豆蔻酸淀粉酯的取代度随着脂肪酶添加量的增加呈现先增大后降低的趋势，当脂肪酶添加量为2%时，其取代度达到最大为0.056±0.003（图1）。酶浓度的提高仅仅缩短了到达反应平衡的时间，当酶浓度升高到一定程度时，再增加其浓度，取代度不仅不再明显上升，反而有所下降。主要原因是脂肪酶发生团聚影响底物与酶活性中心的接触［4］。并且由于酶添加量的增多，反应体系黏稠度增加，不利于产物的形成。综上，本试验脂肪酶添加量应选择2%。

2.2 傅里叶红外光谱分析（FTIR）

对比图2中不同样品的红外光谱图可发现，马铃薯原淀粉及不同DS的肉豆蔻酸淀粉酯在3 438.46 cm-1附近都出现了强而宽的—OH伸缩振动和羟基氢键缔合后的特征吸收峰。但是，不同DS淀粉酯光谱图中—OH的吸收峰明显低于马铃薯原淀粉，并且随着DS的增加该特征吸收峰越来越平缓。这是由于淀粉中的一部分羟基被酯化形成羰基，使—OH总体数量减少，可证明淀粉成功接枝了脂肪酸形成酯。1 743 cm-1处的吸收峰是酯羰基＝CO的伸缩振动吸收峰，是酯的特征吸收峰［18］，对比图5中的6条红外光谱曲线，可发现在此波数处出现酯羰基的特征吸收峰，并且随着DS的增大，该吸收峰略有升高，但由于DS都比较低，吸收峰不是很明显。

图2 马铃薯原淀粉与肉豆蔻酸淀粉酯（DS：0.025～0.056）的红外光谱图

2.3 淀粉质构特性

从表1可以看出，马铃薯原淀粉与不同取代度的酯化淀粉的内聚性、回复性无明显变化。与原淀粉相比，酯化淀粉的硬度、胶黏性、咀嚼性变小，而弹性有所增大。这主要是由于由于长链脂肪酸疏水性有机碳链的引入，导致分子间氢键的断裂，淀粉的晶体结构被破坏，分子结构松散，分子的缠结点减少，致使淀粉的凝胶强度变弱［19］。

表1 淀粉质构特性参数

2.4 疏水性测试

对肉豆蔻酸淀粉酯的疏水性进行定性测试，将样品置于含有等体积蒸馏水和石油醚的两相试管中。马铃薯原淀粉立即下沉至水相中，呈现不透明状（图3a）。相反，肉豆蔻酸淀粉酯没有立即下沉至水相，反而漂浮在非极性与极性相间（图3b～图3f）。说明乙酰化淀粉优先留在上层有机相的最底层。尽管该方法较简单，但仍然可证明酯化淀粉表面极性的改变。

图3 疏水性结果

2.5 乳状液微观结构分析

图4 乳状液在37℃烘箱内储藏第1天的微观结构图

图5 乳状液在37℃烘箱内储藏第12天的微观结构图

为了反映不同DS的肉豆蔻酸淀粉酯的乳状液稳定性的区别，对6组乳状液进行储藏试验，在第1天和第12天采用数码显微镜对乳状液的微观结构进行观察。从图4～图5中可以看出，在第1天时，相对原淀粉形成的乳状液体系（图4a）而言，酯化淀粉（图4b～图4f）油滴平均粒径较大，且分布均匀。贮藏12 d后，原淀粉形成的乳状液已发生聚集和絮凝（图5a），对酯化淀粉而言，乳状液油滴平均粒径增大，但未发生明显的聚集和絮凝，且酯化淀粉取代度越大，乳状液油滴平均粒径增大越小，乳状液体系稳定（图5b～图5f）。

3 结论

试验研究了在无溶剂体系中，不同反应条件对肉豆蔻酸淀粉酯取代度的影响。改变反应条件，可制得取代度为0.025～0.056范围内的肉豆蔻酸淀粉酯，且反应温度为60℃、脂肪酶添加量为2%、底物比为1∶4、反应时间为25 h时制得的肉豆蔻酸淀粉酯的取代度为0.056。并应用FTIR、TA.XT型质构仪、数码显微镜等，对原淀粉及不同取代度的酯化淀粉的物化性质进行研究。FTIR验证了酯化淀粉的生成；疏水性定性测定验证了疏水性基团的引入。研究表明，酯化淀粉的疏水性、乳状液稳定性较原淀粉有很大改善，而其凝胶强度较原淀粉有所下降，更有利于工业生产。且无溶剂体系酶促合成肉豆蔻酸淀粉酯，为中长链脂肪酸淀粉酯制备的理论研究提供了依据。

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Solvent-Free System Enzymatic Synthesis of Myristate Acid Starch Ester and Properties

Bao Xuemei Niu Lili Wang Yue Chen Jin Yu Jie Fang Linkai Zhang Zhen Zhang Shenggui

（College of Food Science and Engineering，Gansu Agriculture University，Lanzhou 730070）Abstract In the solvent-free system，myristic acid and potato starch were used as raw materials，using Novozyme 435 as catalyst，to prepare starch myristate with different degrees of substitution.Effects of reaction temperature，the amount of lipase，starch／myristate acid weight ratio and reaction time on the degree of substitution of starch esters were studied.Then chemical and physical properties of native potato starch and esterified starch with different degrees of substitution were measured.The results showed the DS of the esterified starch was 0.056 when reaction temperature was 60℃，lipase dosage was 2%，substrate ratio was 1∶4，and reaction time was 25 h.Esterified starch had good hydrophobicity and emulsion stability，and the gel strength was declined compared with the native starch.

enzymatic synthesis，potato starch，starch myristate

S532

A

1003-0174（2017）01-0029-06

甘肃省农业生物技术研究与应用开发（GNSW-2014 -10），甘肃省农业科技创新（GNCX-2012-43）

2015-06-24

包雪梅，女，1991年出生，硕士，农产品加工及贮藏工程

张盛贵，男，1970年出生，教授，淀粉深加工