转2mG2-epsps基因水稻种子蛋白质非预期变异分析

李燕燕 赵 艳

（浙江工商大学食品与生物工程学院，杭州 310018）

转2mG2-epsps基因水稻种子蛋白质非预期变异分析

李燕燕 赵 艳

（浙江工商大学食品与生物工程学院，杭州 310018）

以转2mG2-epsps基因抗草甘膦水稻为材料，根据实质等同性原则，分析转基因（genetically modified，GM）水稻种子可溶性蛋白含量和组分的非预期变异。结果表明：与非转基因亲本相比，GM水稻种子的总可溶性蛋白含量极显著降低，主要受谷蛋白含量变异影响。但清、球、醇、谷4种蛋白含量的最高变异幅度（9.12%）低于P1和P2两亲本之间的最大差异幅度（14.67%）。说明GM水稻种子的可溶性蛋白含量非预期变异在安全范围内，但营养品质可能与亲本品系存在差异。SDS-PAGE分析发现，GM水稻株系T12和T22分别有12和14个蛋白谱带发生了非预期变异，涉及4种可溶性蛋白的组分，多数表现为含量变化。突出的是，2个GM水稻株系中均新增加了41 ku和56 ku谷蛋白组分，需要进一步通过毒理学分析评价其食品安全性。

转基因水稻 种子可溶性蛋白 实质等同性 非预期变异

水稻作为全球最重要的农作物，近年来面积和单产的增长率逐年变小，病虫草害和自然灾害频发是主要的诱因［1］，杂草稻与水稻争光、争水、争肥，严重威胁水稻生产，造成水稻减产［2］。草甘膦是一种高效、广谱除草剂，由于其作用的靶标酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）只存在于植物和微生物中，具有很高的毒理学和环境安全性。由于草甘膦除草剂集中了高效、安全、低成本、无残留、易降解等诸多优点，从1996年以来，草甘膦／抗草甘膦转基因农作物的杂草控制模式取得了巨大成功，世界范围内约90%的转基因（genetically modified，GM）农作物携带草甘膦抗性基因［3］。抗草甘膦除草剂GM水稻新品种的培育对于杂草控制和提高水稻产量有重要现实意义。2mG2-epsps是我国科学家林敏从荧光假单胞菌（pseudom onas fluorescens）G2菌株中克隆后经优化改造获得的耐草甘膦新基因，具有自主知识产权［4］，本课题组前期培育成功的转2mG2-epsps基因GM水稻新品系应用前景广阔。

国际社会对GM作物及食品的安全性存在广泛争议，公众对GM作物非预期变异效应影响人类健康的担忧是GM作物商品化应用的主要障碍［5］。非预期效应是指除了由目的基因插入产生的可预料效应之外，在相同环境和条件下种植的GM作物与非转基因亲本在表型、反应和成分上所表现的统计学显著差异［6］。人们担心GM作物的非预期效应可能影响食品的营养价值，甚至可能产生对人类和动物健康有害的毒素［5］。1993年OECD（Organization for Economic Cooperation and Development）提出的实质等同性原则是GM食品安全性评价的重要依据，旨在通过比对分析识别GM作物与亲本之间相似的和不等同的新成分，然后对新成分进行进一步的毒理学评价［7］。在成分比对方面，由于DNA和RNA通常不具有食品安全风险，GM作物安全性评价主要以基因表达产物特别是蛋白质作为分析对象［8］。根据溶解性，稻米蛋白可分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白［9］。本研究根据实质等同性原则，分析抗草甘膦GM水稻种子可溶性蛋白含量和组分的非预期变异，为抗草甘膦GM水稻的安全性评价和商品化应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转2mG2-epsps基因纯合株系T12、T22和各自的非转基因亲本对照粳稻品种日本晴（P1）、JP574（P2），于2013年12月种植于海南转基因试验田，2014年5月收获水稻种子，自然晒干后4℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 稻米可溶性蛋白提取

水稻种子经脱壳、磨粉、过80目筛，用丙酮脱脂制成脱脂米粉。按参考文献［9］方法，分别用蒸馏水、5%NaCl、70%乙醇和0.1 mol／L NaOH依次从脱脂米粉中分级提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白。采用Bradford方法［10］测定蛋白质浓度，换算出每g脱脂米粉中各种可溶性蛋白的含量。

蛋白含量（mg／g脱脂米粉）＝蛋白浓度（mg／mL）×提取液体积（mL）／脱脂米粉质量（g）

1.2.2 稻米蛋白组分SDS-PAGE分析

参照江绍玫等［11］的SDS-PAGE电泳法分析稻米4种蛋白组分。采用Tris-甘氨酸高pH不连续缓冲系统，14%分离胶，5%浓缩胶，每孔上样蛋白质量为8 μg。采用恒压式电泳，浓缩胶电压为80 V，样品进入分离胶后调至130 V。电泳结束后经考马斯亮蓝R-250染色，脱色后，用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，用Quantity one软件对电泳图谱中的蛋白质组分条带进行定量取值分析。

1.2.3 数据处理与统计分析

水稻种子可溶性蛋白含量测定时，每个样品设3次重复，结果以X±s（平均数±标准误）表示，并以P为对照，应用Origin软件对GM水稻样本数据进行差异显著性统计分析。

用Quantity one软件对SDS-PAGE电泳条带进行扫描定量分析取值时，将亲本具有的蛋白组分条带含量取值定义为1，当GM水稻样本某蛋白组分含量的取值比亲本相应的条带增加或减少0.40倍和0.80倍以上时，标记为该蛋白组分与亲本差异显著和极显著，视为非预期变异组分。

分别以P1和P2为对照，对T12和T22 2个GM水稻株系的种子可溶性蛋白含量进行差异显著性分析（表1），并将T12和T22的可溶性蛋白含量变异趋势和幅度汇总于表2。T12和T22的总可溶性蛋白含量分别比各自亲本降低3.43%和6.43%，差异显著。T12的球蛋白含量比P1显著增加，谷蛋白却比P1极显著降低。T22株系除了清蛋白含量比亲本显著增加外，球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量均比P2

显著或极显著降低，变异幅度在3.86%～9.12%之间。由于谷蛋白占比最多，因此，GM水稻种子总可溶性蛋白含量降低的变异幅度主要由谷蛋白含量决定。

表1 转基因水稻与亲本种子可溶性蛋白含量（mg／g米粉）变异分析

表2 转基因水稻种子可溶性蛋白含量变异趋势和幅度汇总

2 结果与分析

2.1 GM水稻的种子蛋白含量变异分析

T12和T22这2个GM水稻株系与各自亲本的种子可溶性蛋白质含量的比较结果见表1。2个亲本品种P1和P2的可溶性蛋白质含量差异显著，P2品种的总可溶性蛋白显著高于P1。4种可溶性蛋白中，谷蛋白占比最大，分别达到P1和P2总可溶性蛋白的67.67%和65.27%，但在2个亲本品种间谷含量差异不显著。P2的清、球、醇溶蛋白含量分别比P1增加6.27%、14.67%、9.95%，说明水稻种子可溶性蛋白质含量存在天然的品种差异。

2.2 GM水稻种子蛋白组分变异的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析时，由于考马斯亮蓝R250染料与蛋白质的定量结合效应，电泳后单个样本对应的泳道中分离的蛋白条带染色的浓淡可反映组分在总蛋白含量中的相对占比。对于不同样本而言，只有当上样的蛋白质量相等时，才能根据条带显色的浓淡比较分子量相同的蛋白组分在不同样本间的含量差异。将GM水稻株系T12、T22及其各自亲本种子的4种可溶性蛋白（清、球、醇、谷）提取液定量测定后，根据蛋白浓度调整电泳上样量均为8 μg，进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图1。由于电泳分析时各样本上样量一致，所以电泳条带的浓淡可以反映相应蛋白组分的相对含量多少，根据扫描定量取值结果，将2个转基因样本T12和T22相对亲本的种子蛋白变异组分信息汇总至表3，同时列出分子量为14～16 ku的水稻过敏原蛋白条带的定量取值分析结果。

2.2.1 非转基因亲本P1和P2的种子蛋白组分比较

水稻种子清蛋白（图1a）条带最多，蛋白组分复杂，从正极到负极分子质量分布范围在9～100 ku之间。P1和P2的清蛋白电泳图谱相似，组分的含量差值均低于0.4倍，差异不显著。球蛋白组分的电泳条带在图谱中分布清晰（图1b），共12个条带，P1与P2组分一致，只是P2的24 ku和56 ku球蛋白组分含量比P1分别增加0.80倍和0.75倍，差异显著。醇溶蛋白组分集中于14～16 ku区域（图1c），P1的醇溶蛋白组分的电泳条带14 ku和16 ku比P2的稍淡；两亲本谷蛋白组分的电泳图谱相似，都包括9、14、19～23、33～38、41和56 ku（图1d）。在本研究定义的差异水平条件下，P1和P2的清蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白组分差异不显著，仅球蛋白的个别组分在含量上有所不同。

图1 转基因水稻株系与非转基因亲本种子蛋白组分的SDS-PAGE电泳图谱

2.2.2 GM水稻种子蛋白组分变异分析

GM水稻株系T12、T22与各自亲本的清蛋白的电泳图谱比较分析结果（图1a和表3）表明，T12的89 ku清蛋白含量比P1增加0.42倍，T22株系的89 ku清蛋白含量却比P2减少0.43倍，差异显著。从图1b和表3结果可知，GM水稻种子球蛋白组分变异较多。与亲本P1相比，T12株系的65、56、24 ku含量显著增加，变异幅度在0.61～0.65倍之间。T22株系65、57、56、24、21 ku含量显著降低，仅相当于P2相应组分含量的1%～55%。

T12和T22株系的14～16 ku醇溶蛋白组分与相应亲本相比，含量有变化，但差异不显著（图1c和表3）。谷蛋白电泳图中（图1d），T12和T22与各自的亲本相比，变异趋势一致，突出的非预期变异是均新增加了56 ku和41 ku条带。并且33～38 ku、19～23 ku条带含量显著增加，100 ku和9 ku条带含量比亲本显著减少，取值变异幅度在0.48～0.82倍之间（表3）。

总体上，GM水稻种子的清、球、醇、谷4种蛋白均存在显著变异的蛋白组分，除了新增的41 ku和56 ku谷蛋白外，其他蛋白组分的非预期变异主要表现为含量上的增加或降低。

表3 转基因水稻与非转基因亲本相比种子蛋白组分变异情况汇总

2.2.3 GM水稻种子14～16 ku蛋白组分的变异分析

对于GM水稻蛋白组分的安全性评价中，作为稻米主要抗营养因子的过敏原蛋白非常值得关注。其中14～16 ku蛋白包含水稻常见的主要过敏原。图1显示，水稻种子清、球、醇溶蛋白电泳图谱中均包含14～16 ku蛋白区带，谷蛋白只有14 ku蛋白条带。定量取值结果（表3）表明，虽然4种可溶性蛋白中，GM水稻14～16 ku蛋白与亲本相比未达到本试验定义的差异显著水平（比亲本增加或降低0.4倍及以上），但含量出现变化。其中T12株系的14～16 ku醇溶蛋白含量比P1增加了21%，14 ku谷蛋白组分含量则比P1降低了25%。T22株系的14～16 ku清蛋白含量比P2增加了32%，14～16 ku醇溶蛋白和谷蛋白组分含量分别比亲本降低了30%和21%。

3 讨论

培育抗草甘膦转基因水稻对稻田杂草控制意义重大［12］。实质等同性评价是转基因水稻商品化应用的必要前提。结果表明，2个抗草甘膦GM水稻株系T12和T22的种子可溶性蛋白含量和组分均存在非预期变异。这与前人对转基因水稻蛋白质变异的研究结果类似［13-14］。

稻米蛋白在水稻不同亚型、品种间存在明显差异［15］。本试验GM水稻种子的清、球、醇、谷4种可溶性蛋白含量的最高变异幅度（9.12%）低于P1和P2两亲本之间的最大差异幅度（14.67%）。2004年，OECD发布的水稻新品种关键营养成分含量的共识性文件显示，糙米蛋白含量为7.1%～8.3%［16］，GM水稻株系T12和T22的总可溶性含量分别为71.77和71.32 mg／g，属于水稻的正常变异范围。然而，稻米蛋白组分对营养品质影响较大，比如清蛋白和球蛋白含多种生理活性蛋白［17］，其中稻米α-球蛋白能显著降低小鼠血清中的胆固醇［18］，14～16 ku蛋白中的淀粉酶抑制剂具有降血糖的生理功能，也可能引发食物过敏反应［19-20］。因此，GM水稻种子的营养品质可能与亲本品系存在差异。

在蛋白组分方面，GM水稻T12和T22株系分别有12和14个蛋白谱带发生了非预期变异，涉及清、球、醇、谷4种可溶性蛋白组分，多数表现为含量的增减。以谷蛋白组分为例说明蛋白电泳条带反映的组分变异与总蛋白含量之间的关系。与亲本相比，2个GM水稻株系的33～38 ku、19～24 ku谷蛋白条带含量显著增加，甚至产生了56 ku、41 ku新组分，但不能由此预测GM水稻总谷蛋白含量的变异方向是增加。这是因为谷蛋白组分的SDS-PAGE分析是以各对比样本电泳上样总蛋白量相等为前提的，条带浓度增加只能说明其相对含量占比在GM水稻总谷蛋白中提高。同理，GM水稻100 ku和9 ku谷蛋白条带的相对含量占比比亲本显著减少（图1d和表3）。事实上，GM水稻株系T12和T22的总谷蛋白含量均比亲本极显著降低（表1），由于谷蛋白含量占比高达稻米总蛋白的75%～90%［16］，GM水稻种子总可溶性蛋白含量显著降低的变异可能主要受谷蛋白含量变异影响。从安全的角度，2个GM水稻株系新增加的41 ku和56 ku谷蛋白组分，需要进一步的食品毒理学评价。

过敏原是GM水稻安全性评价的关键因素。虽然2个GM水稻株系14～16 ku蛋白组分含量与亲本相比未达到本试验定义的差异显著水平（表3），但含量变化仍值得关注，因为14～16ku清蛋白和球蛋白包含水稻主要的过敏原蛋白［16，20］，其相对含量占比可能影响GM稻米的过敏原性。其中T22株系的14～16 ku清蛋白含量比P2增加了32%，T12株系的14～16 ku清蛋白和球蛋白含量与P1表现为实质等同。可见，对GM水稻株系的过敏原安全性评价应遵从个案分析原则。

需要指出的是，以非转基因亲本为对照样本的实质等同性比对结果，不能揭示GM水稻非预期变异的技术来源，无法判定这些非预期变异由转基因插入引起。这是因为，GM水稻的培育包括多个技术环节，特别是GM水稻经历的组织培养也可能导致非预期变异效应［21］，由组织培养导致的无性系变异（somaclonal variation）应用于小麦、玉米、水稻、高粱等的品种改良已有数十年的历史［22］，目前不需要进行安全性评估就能应用于生产实践。Zhou等［23］报道组织培养对水稻的代谢物轮廓谱的改变比转基因插入的影响更显著。Herman等［24］在综述20年来GM作物与非转基因对照之间的实质等同性分析结果的基础上，指出怀疑转基因技术比传统育种手段可能引发更严重的非预期变异缺乏事实依据。建议在实质等同性分析时，增加GM水稻培养过程中获得的组织培养再生株系作为对照样本，区分GM水稻的非预期变异来源于转基因插入突变还是组织培养无性系变异，能为GM水稻的安全性评价提供更充分的实验依据。

4 结论

抗草甘膦GM水稻株系T12和T22的种子可溶性蛋白含量和组分均存在非预期变异，但清、球、醇、谷4种可溶性蛋白含量的变异幅度在安全范围内，组分变异多数为含量的增减。GM水稻种子的营养品质可能与亲本存在差异。GM水稻株系新增加的41 ku和56ku谷蛋白组分需要进一步的食品安全性评价。

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Analysis of Protein Unintended Variation of Transgenic Rice Seeds with 2mG2-epsps Gene

Li Yanyan Zhao Yan

（College of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310018）

The unintended variation of soluble protein contents and components of genetically modified（GM）rice seeds were analyzed，using glyphosate-resistant GM rice lines harboring 2mG2-epsps gene as materials，according to the principle of substantial equivalence.The results showed that the total soluble protein contents of GM rice seeds decreased very significantly，which were mainly affected by the glutenin content variation，compared to the non-transgenic parent lines.While the maximum content variation range（9.12%）from four kinds of proteins including albumin，globulin，prolamin，glutenin，was lower than the variation difference（14.67%）between the two parent varieties，P1 and P2.This indicated that the unintended variation of soluble protein contents of GM rice lines was within the safety range，but the nutritional quality of GM rice seeds might be different from their parent varieties. SDS-PAGE analysis reveals that there were 12 and 14 unintended variation protein bands in the respective GM rice line T12 and T22，concerning components of four kinds of soluble proteins and most exhibit content changes.Notably，two new glutenin bands of 41 ku and 56 ku were produced in all the two GM rice lines，which must be subjected to further toxicology test for food safety evaluation.

genetically modified rice，seed soluble proteins，substantial equivalence，unintended variation

S188

A

1003-0174（2017）01-0001-06

国家自然科学基金（30871511），农业部转基因生物新品种培育重大专项（2011ZX 08010-003）

2015-04-23

李燕燕，女，1987年出生，硕士，生物工程

赵艳，女，1970年出生，教授，植物生化与分子生物学